שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels
Summary
. הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.
Abstract
מחסום הדם – מוח (BBB) היא רקמה מכשול דינמי המגיבה לגירויים שונים הקשורים pathophysiological ולא תרופתי. שינויים כאלה הנובעות גירוי יכול במידה רבה לווסת את משלוח סמים למוח ולגרום, לפי סיומת, אתגרים ניכרים בטיפול של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מחלות. שינויים BBB רבים המשפיעים על pharmacotherapy, לערב חלבונים לשפות אחרות, בא לידי ביטוי ברמה של תאי אנדותל. אכן, ידיעה על BBB הפיזיולוגיה על בריאות ומחלה עוררה עניין רב במחקר של חלבונים אלה ממברנה. מבחינת מחקר מדע בסיסי, זה מרמז על דרישה עבור שיטה פשוטה אך חזקים לשחזור עבור בידוד של microvessels של רקמת המוח שנקטפו חיות ניסוי. לשם הכנת ממברנה דגימות microvessels טרי מבודד, זה חיוני כי ההכנות המדגם להיות מועשר בתאי האנדותל אבל מוגבלת בנוכחות סוגי תאים אחרים של היחידה נוירו-וסקולריים (קרי, האסטרוציטים מיקרוגלייה, הנוירונים, pericytes). יתרון נוסף הוא היכולת להכין דגימות מבעלי חיים בודדים על מנת ללכוד את ההשתנות נכון של חלבונים ביטוי אוכלוסיה ניסיוני. כתב יד זה, ניתנים פרטים בנוגע שיטה כי הוא מנוצל עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels והכנת דוגמאות ממברנה. Microvessel העשרה, מדגימות נגזר, מושגת באמצעות ארבעה שלבים צנטריפוגה איפה לתוספי נכלל במאגר של הדגימה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות על ידי מעבדות אחרות עבור יישומים ספציפיים משלהם. דוגמאות שנוצר מתוך פרוטוקול זה הוכחו תשואות נתונים ניסיוני של ניסויים ניתוח חלבון זה יכול לסייע מאוד את ההבנה של BBB תגובות לגירויים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological, תרופתי.
Introduction
מחסום הדם – מוח (BBB) קיים ממשק בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) את מחזור מערכתי ואת ממלא תפקיד חיוני שמירה על הומאוסטזיס המוח. באופן ספציפי, BBB הפונקציות בדיוק שליטה ממס ריכוזי נוזל חוץ-תאי המוח, לספק ביעילות המזינים הללו הנדרשים על ידי רקמת המוח כדי למלא את דרישות המטבולית ניכר של ה-CNS1. תפקידים אלה לרמוז כי BBB, אשר קיים בעיקר ברמה של תא אנדותל microvascular, צריך להחזיק דיסקרטית מנגנונים המאפשרים כמה חומרים לגשת parenchyma המוח תוך הבטחת ואינטראקציות מזיקים לא יכול לצבור. אכן, תאי אנדותל microvascular המוח אינם fenestrated, התערוכה פינוציטוזה מוגבלת, אשר מבטיחים מחסור של חדירות לא בררניים2. בנוסף, תאי אנדותל של המוח microvessel אקספרס צמוד לצומת, adherens צומת חלבונים לפעול טופס בדיקה גופנית “לאטום” בין תאי אנדותל סמוכים ולהגביל במידה רבה paracellular דיפוזיה של חומרים נישא בדם לתוך המוח parenchyma. אכן, חדירות סלקטיבית של חומרים אנדוגניים ו אקסוגני מחייב ביטוי פונקציונאלי של ספיגת ו בזרימת מובילי3. צמתי הכללית, חזק, צמתי adherens, מסועי לעבוד ביחד כדי לשמור על המאפיינים מכשול ייחודי של BBB.
BBB היא מכשול דינאמי מגיב לגירויים פיזיולוגיים הקשורים pathophysiological, תרופתי. לדוגמה, היפוקסיה/reoxygenation מתח הוכח לווסת ביטוי של חלבונים צומת קריטית חזק (קרי, occludin, zonulae occluden-1 (זואי-1)), אשר מזוהה עם חדירות מוגברת paracellular אל כלי דם סמנים כזה כמו סוכרוז4,5,6. תצפיות דומות שנעשו ב- BBB בסביבה של פגיעה מוחית טראומטית7 ו-8,כאבים דלקתיים היקפיים9. אלה אותן מחלות יכול גם לווסת את מנגנוני הובלה ב BBB10,11,12,13,14. אכן, היפוקסיה/reoxygenation פגיעה מגבירה ביטוי פונקציונאלי אורגני אניון. מעביר מפוליפפטיד 1a4 (Oatp1a4) ב- BBB, אשר יכול להוביל עליות משמעותיות התעבורה דם-כדי-מוח של סובסטרטים תחבורה Oatp ספציפיים כגון taurocholate ו atorvastatin13. מאפייני BBB יכול להשתנות גם ע י pharmacotherapy עצמו, מנגנון זה יכול ליצור בסיס עבור שני שינויים עמוקים של אפקטיביות התרופה במוח, סמים-תרופתיות. לדוגמה, פרצטמול מטרות קולטן גרעיני מנגנוני איתות ב microvascular אנדותל תאי המוח, מגביר ביטוי פונקציונאלי של המשגר בזרימת קריטי P-גליקופרוטאין (P-gp), ומשנה תלויי-זמן שיכוך כאבים שהוענקו מורפיום, כאבים אופיואידים סמים ו P-gp הוקמה תחבורה המצע15. הבנה מעמיקה של שינויים BBB, יכולה להיגרם על ידי מחלות או סמים, דורש גם זיהוי ואפיון של מנגנוני הרגולציה ספציפי לשלוט לבצע שינויים אלה. אכן, דיסקרטית איתות המסלולים זוהו תאי אנדותל microvascular המוח לשלוט הביטוי מולקולרית של צומת חזק חלבונים16,17 ו מובילי15, 18,19. יחדיו, תצפיות אלה מציינים מורכבים מסלולים מולקולריים המעורבים ברגולציה של צמתי צר BBB, מסועי על בריאות ומחלה.
אתגר משמעותי במחקר של BBB היא הדרישה המוחלטת של שיטה פשוטה ויעילה עבור בידוד של microvessels של רקמת המוח נגזר חיות ניסוי והכנה עוקבות של דגימות ממברנה. דגימות אלה חייבים להיות מוכנים כך הם גם מועשר בתאי האנדותל microvascular המוח, מוגבל בנוכחות של סוגי תאים אחרים. במהלך השנים האחרונות, מתודולוגיות מרובים עבור בידוד של microvasculature מהמוח מכרסמים דווחו21,2220,13,הספרות המדעית. מאמר זה מתאר פשוט, חזקה, בעלת שיטה לשחזור עבור בידוד של microvessels מהמוח עכברוש, הכנת דוגמאות מועשרת ממברנה אנדותל שיכול לשמש לניתוח של ביטוי חלבון. יתרון של הפרוטוקול בידוד microvessel היא היכולת להשיג תכשירים לדוגמה באיכות גבוהה ועם תשואה מספיק חלבון של חיה ניסיוני בודדים. פעולה זו מאפשרת השיקול ההשתנות הבין-בעלי חיים בביטוי חלבונים. כזה מקדמה של פרוטוקול זה השתפרה במידה החוסן של BBB מחקרים כי הערכת יתר (או תת הערכה) על המשמעות האמיתית של חלבון שינויים ב- BBB עכשיו ניתן להימנע. בנוסף, הכללת מספר השלבים צנטריפוגה עם לתוספי מאפשר העשרת משופרת של microvessels בדגימות ניסיוני תוך עידוד הסרה של המרכיבים הסלולר לא רצויות כגון נוירונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה מתוארת שיטה פשוטה ויעילה של הכנת דגימות חלבון ממברנה microvessels טרי מבודד מן החולדה רקמת המוח. דווח על מספר גישות עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels ו/או דור של ההכנות ממברנה מ microvasculature מבודדים21,22 20,13,ספרות , <sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מכוני הבריאות הלאומיים (R01-NS084941), אריזונה הנציבות מחקר ביו-רפואי (ADHS16-162406) PTR. ווה קיבל בעבר תמיכה של פגישה מראש הדוקטורט נבחרת מוסדות של בריאות הכשרה למענק (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?. AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
