Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten
Summary
Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.
Abstract
Die Blut – Hirn-Schranke (BBB) ist eine dynamische Barriere-Gewebe, die auf verschiedenen pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Solche Veränderungen, die durch diese Reize können stark modulieren Drug-Delivery zum Gehirn und durch Verlängerung, erhebliche Herausforderungen bei der Behandlung des zentralen Nervensystems (ZNS) Krankheiten verursachen. Viele BBB-Veränderungen, die Pharmakotherapie, beeinflussen beinhalten Proteine, die lokalisiert und auf der Ebene der Endothelzellen ausgedrückt. In der Tat hat dieses Wissen über die Physiologie der BBB in Gesundheit und Krankheit erhebliches Interesse an der Erforschung dieser Membran Proteine ausgelöst. Aus Sicht der wissenschaftlichen Grundlagen-Forschung bedeutet dies eine Anforderung für eine einfache, aber robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren geerntet. Um Membran Proben aus frisch isolierte mikrogefäßen vorzubereiten, ist es wichtig, dass Probe Vorbereitungen in Endothelzellen bereichert aber in Gegenwart von anderen Zelltypen der Neurovaskuläre Einheit (z.B. Astrozyten, Mikroglia, Neuronen begrenzt, perizyten). Ein weiterer Vorteil ist die Fähigkeit, Proben von einzelnen Tieren vorzubereiten, um die wahre Variabilität der Proteinexpression in einer experimentellen Bevölkerung zu erfassen. In dieser Handschrift sind Einzelheiten über eine Methode, die verwendet wird für die Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und Vorbereitung der Membran-Proben zur Verfügung gestellt. Kapilläre Anreicherung von Proben abgeleitet, ist erreicht, indem vier Zentrifugation Schritte wo Dextran in den Probenpuffer aufgenommen. Dieses Protokoll kann leicht durch andere Labore für ihre eigenen spezifischen Anwendungen angepasst werden. Proben aus diesem Protokoll generiert wurden gezeigt, robuste Versuchsdaten aus Protein-Analyse Experimente liefern, die das Verständnis der BBB Reaktionen auf physiologische und pathophysiologische pharmakologische Reize sehr helfen können.
Introduction
Die Blut – Hirn-Schranke (BBB) ist an der Schnittstelle zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und die systemische Zirkulation vorhanden und spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Insbesondere die BBB-Funktionen, um präzise Kontrolle gelösten Konzentrationen im Gehirn extrazellulären Flüssigkeit und effizient diese Nährstoffe liefern, die von Hirngewebe benötigt werden, um die erheblichen metabolischen Anforderungen der CNS1zu erfüllen. Diese Rollen implizieren, dass die BBB, die in erster Linie auf der Ebene der mikrovaskuläre Endothelzellen existiert, diskrete Mechanismen besitzen muss, die es einige Substanzen in Anwesenheit von ermöglichen gleichzeitig sicherstellen, dass potenziell schädliche XENOBIOTIKA können nicht zugreifen akkumulieren. In der Tat Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen sind nicht gefenstert und begrenzten Pinozytose, sorgt für einen Mangel an nicht-selektive Durchlässigkeit2weisen. Darüber hinaus äußern Gehirn kapilläre Endothelzellen engen Kreuzung und Adherens Junction Proteine, die handeln in Form eine körperlichen “Siegel” zwischen benachbarten endothelial Zellen und parazellulär Diffusion von Blut übertragbare Substanzen ins Gehirn stark einschränken Parenchym. In der Tat erfordert selektive Durchlässigkeit der endogene und exogene Stoffe funktionelle Expression von Aufnahme und Efflux-Transporter3. Insgesamt, engen Kreuzungen, Adherens Junctions und Transportern arbeiten gemeinsam, um die einzigartige Barriereeigenschaften der BBB zu pflegen.
Die BBB ist eine dynamische Barriere, die auf physiologischen, pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Z. B. Hypoxie/flussbettfilters Stress erwiesenermaßen modulieren Ausdruck der kritischen tight Junction-Proteine (z.B. occludin, Zonulae Occluden-1 (ZO-1)), die erhöhte parazellulär Durchlässigkeit für solche vaskuläre Marker zugeordnet ist als Saccharose4,5,6. Ähnliche Beobachtungen wurden an der BBB in der Umgebung von Schädel-Hirn-Verletzung-7 und peripheren entzündliche Schmerzen8,9. Diese gleichen Krankheiten können auch Transportmechanismen an der BBB10,11,12,13,14modulieren. In der Tat, Hypoxie/flussbettfilters Verletzungen verbessert funktionelle Expression von Bio Anion Transport Polypeptid 1a4 (Oatp1a4) an der BBB führen kann zu einem signifikanten Anstieg in der Blut-Hirn-Transport von bestimmten Oatp Transport Substrate wie Taurocholate und Atorvastatin13. BBB-Eigenschaften können auch durch Pharmakotherapie selbst, einen Mechanismus geändert werden, die eine Grundlage für beide tief greifende Veränderungen in der Wirksamkeit der Droge im Gehirn und Wechselwirkungen bilden können. Z.B. Paracetamol Ziele nuklearen Rezeptoren Signalisierung Mechanismen im Gehirn der mikrovaskuläre Endothelzellen, erhöht die funktionelle Expression der kritischen Efflux-Transporter P-Glykoprotein (P-Gp), und ändert zeitabhängige Analgesie Übertragen von Morphin, transportieren ein opioid-Analgetikum und etablierten P-Gp Substrat15. Ein gründliches Verständnis der BBB-Änderungen, die durch Krankheiten oder durch Drogen induziert werden kann, erfordert auch die Identifizierung und Charakterisierung der spezifischen regulatorischen Mechanismen, die diese Änderungen zu kontrollieren. In der Tat, diskrete Signalwege wurden im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen, die Steuern, die molekulare Ausdruck der engen Kreuzung Proteine16,17 und Transporter15, 18,19. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass komplexe Molekulare Signalwege in der Verordnung von BBB tight Junctions und Transporter in Gesundheit und Krankheit beteiligt sind.
Eine große Herausforderung in der Studie der BBB ist die absolute Voraussetzung für eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren und anschließende Aufbereitung der Membran Proben abgeleitet. Diese Proben müssen vorbereitet werden, so dass sie sowohl im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen angereichert und in Anwesenheit von anderen Zelltypen begrenzt. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Methoden zur Isolierung von Microvasculature von Nagetier Gehirn in der wissenschaftlichen Literatur13,20,21,22beschrieben. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, robuste, und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus rattengehirn und zur Vorbereitung von endothelialen Membran angereicherten Proben, die für die Analyse der Proteinexpression verwendet werden können. Vorteil dieses Protokolls kapilläre Isolierung ist die Fähigkeit, eine einzelne Versuchstier Probe Vorbereitungen von hoher Qualität und mit ausreichend Proteinausbeute einzuholen. Dies ermöglicht die Berücksichtigung der Inter Tier Variabilität der Proteinexpression. Solch ein Fortschritt in diesem Protokoll hat die Robustheit des BBB Studien erheblich verbessert, weil Überbewertung oder Unterbewertung das wahre Ausmaß der Protein Veränderungen an der BBB jetzt vermieden werden kann. Darüber hinaus ermöglicht die Aufnahme von mehreren Schritten der Zentrifugation mit Dextran verbesserte Anreicherung von mikrogefäßen im experimentellen Proben und erleichtert die Entfernung von unerwünschten zelluläre Bestandteile wie Neuronen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel wird eine einfache und effektive Methode der Membrane Protein Probenvorbereitung von mikrogefäßen frisch von Ratte Gehirngewebe isoliert beschrieben. In der Literatur13,20,21,22 wurden mehrere Ansätze zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen oder Generierung von Membran-Zubereitungen aus isolierten Microvasculature gemeldet. , 24. zw…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01-NS084941) und die Arizona biomedizinische Forschungskommission (ADHS16-162406), PTR. WA erhielt vorbei an Unterstützung von Pre-doc Termin für eine nationale Institute der Gesundheit Ausbildung Grant (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
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