En enkel och reproducerbar metod att förbereda membran prover från färska isolerade Rat Brain microvesselsna
Summary
Här beskrivs en metod för isolering av råtta hjärnan microvesselsna och beredning av membran prover. Detta protokoll har den klara fördelen att producera berikad microvessel prover med acceptabel protein avkastning från enskilda djur. Prover kan sedan användas för robust protein analyser på hjärnan mikrovaskulära endotelet.
Abstract
På blod – hjärnbarriären (BBB) är en dynamisk barriär vävnad som reagerar på olika patofysiologiska och farmakologiska stimuli. Sådana förändringar till följd av dessa stimuli kan modulera drogen leverans till hjärnan och, i förlängningen orsaka betydande utmaningar för behandling av centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar. Många BBB ändringar som påverkar farmakoterapi, involverar proteiner som är lokaliserad och uttryckt på nivån av endotelceller. Ja, sådan kunskap på BBB fysiologi vid hälsa och sjukdom har väckt stort intresse i studien av dessa membranproteiner. Från grundläggande vetenskap forskning synpunkt innebär detta ett krav på en enkel men robust och reproducerbar metod för isolering av microvesselsna från hjärnvävnaden skördas från försöksdjur. För att förbereda membran prover från färska isolerade microvesselsna, är det viktigt att provet preparat vara berikad i endotelceller men begränsad i närvaro av andra celltyper neurovaskulära enheten (dvs, astrocyter, mikroglia, neuroner, pericyter). Ytterligare en fördel är möjligheten att förbereda prover från enskilda djur för att fånga sant variabilityen av proteinuttryck i en experimentell befolkning. I detta manuskript finns information om en metod som används för isolering av råtta hjärnan microvesselsna och beredning av membran prover. Microvessel berikning, från prover, uppnås genom att använda fyra centrifugering steg där dextran ingår i provet bufferten. Detta protokoll kan enkelt anpassas genom andra laboratorier för sina egna specifika tillämpningar. Prover som genereras från detta protokoll har visat sig ge robusta experimentella data från protein analys experiment som kan vara till stor hjälp förståelsen av BBB Svaren till fysiologiska, patofysiologiska och farmakologiska stimuli.
Introduction
På blod – hjärnbarriären (BBB) finns på gränssnittet mellan det centrala nervsystemet (CNS) och den systemiska cirkulationen och spelar en viktig roll i upprätthållandet av hjärnan homeostas. Specifikt, BBB funktioner för exakt kontroll koncentrationsgradient koncentrationer i hjärnan extracellulär vätska och att effektivt tillhandahålla de näringsämnen som krävs av hjärnvävnaden att uppfylla de stora metabola krav av CNS1. Dessa roller innebär att BBB, som finns främst på nivån på de mikrovaskulära endotelceller, måste ha diskreta mekanismer som gör att vissa ämnen för att komma åt hjärnparenkymet samtidigt att potentiellt skadliga xenobiotika kan inte ackumuleras. Faktiskt, hjärnan mikrovaskulära endotelceller är inte fenestrated och uppvisar begränsad pinocytosis, vilket garanterar en brist på icke-selektiva permeabilitet2. Dessutom express hjärnan microvessel endotelceller tight junction och adherens junction-proteiner som agerar att bilda en fysisk ”tätning” mellan intilliggande endotelceller och kraftigt begränsa paracellular spridning av blodburna ämnen in hjärnan parenkymet. Faktiskt, selektiv permeabilitet av endogena och exogena ämnen kräver funktionella uttryck för upptag och efflux transportörer3. Övergripande, tight junctions, adherens föreningspunkter och transportörer fungerar i samförstånd för att upprätthålla de unika barriäregenskaper BBB.
BBB är en dynamisk barriär som svarar på fysiologiska, patofysiologiska och farmakologiska stimuli. Till exempel har hypoxi/reoxygenation stress visat att modulera uttrycket av kritiska åtsittande föreningspunkt proteiner (dvs. occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)) som är associerad med ökad paracellular permeabilitet för vaskulär markörer sådana som sackaros4,5,6. Liknande observationer har gjorts på BBB i fastställandet av traumatisk hjärnan skada7 och perifer inflammatorisk smärta8,9. Dessa samma sjukdomar kan också modulera transportmekanismer på BBB10,11,12,13,14. Faktiskt, hypoxi/reoxygenation skada förbättrar funktionell uttryck för organisk anjontransporterande polypeptid 1a4 (Oatp1a4) på BBB, vilket kan leda till betydande ökningar i blod-till-hjärnan transport av särskilda Oatp transport substrat såsom cotransporting och atorvastatin13. BBB egenskaper kan också ändras av farmakoterapi själv, en mekanism som kan ligga till grund för både djupgående förändringar i drogen effektiviteten i hjärnan och för läkemedelsinteraktioner. Till exempel paracetamol mål nukleär receptor signalering mekanismer i hjärnan mikrovaskulära endotelceller, ökar funktionell uttryck för den kritiska transportproteinet P-glykoprotein (P-gp), och ändrar tidsberoende analgesi ges av morfin, transport en opioid smärtstillande läkemedel och etablerade P-gp substrat15. En grundlig förståelse av BBB förändringar, som kan induceras av sjukdomar eller av droger, kräver också identifiering och karakterisering av särskilda reglerande mekanismer som styr dessa ändringar. Faktiskt, diskreta signalvägar har identifierats i hjärnan mikrovaskulära endotelceller som styr molekylära uttrycket åtsittande föreningspunkt proteiner16,17 och transportörer15, 18,19. Sammantaget tyder dessa observationer på att komplexa molekylära vägar är inblandade i regleringen av BBB åtsittande föreningspunkter och transportörer i hälsa och sjukdom.
En stor utmaning i studien av BBB är det absoluta kravet på en enkel och effektiv metod för isolering av microvesselsna från hjärnvävnaden som härrör från försöksdjur och efterföljande beredning av membran prover. Dessa prover måste förberedas så att de är både berikad i hjärnan mikrovaskulära endotelceller och begränsad i närvaro av andra celltyper. Över flera år, har flera metoder för isolering av mikrocirkulation från gnagare hjärnan rapporterats i vetenskaplig litteratur13,20,21,22. Denna artikel beskriver en enkel, robust, och reproducerbar metod för isolering av microvesselsna från råtthjärna och för beredning av endothelial membran-berikad prover som kan användas för analys av proteiner. En fördel med detta microvessel isolering protokoll är förmågan att få provet preparat av hög kvalitet och med tillräckligt protein avkastning från ett enskilt experimentella djur. Detta gör övervägandet av variabilitet i proteinuttryck. Sådant förskott i detta protokoll har förbättrats avsevärt robustheten hos BBB studier eftersom övervärdering (eller underskattning) av sanna omfattningen av protein förändringar på BBB kan nu undvikas. Införandet av flera centrifugering steg med dextran kan dessutom förbättrad anrikningen av microvesselsna i experimentprover underlättar borttagning av oönskade cellulära beståndsdelar såsom nervceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den här artikeln beskrivs en enkel och effektiv metod för att förbereda membran protein prover från microvesselsna nyligen isolerade från råtta hjärnvävnad. Flera metoder för isolering av råtta hjärnan microvesselsna och/eller produktion av membran preparat från isolerade mikrocirkulation har rapporterats i litteraturen13,20,21,22 , 24. även om …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av anslag från National Institutes of Health (R01-NS084941) och Arizona biomedicinsk forskning kommissionen (ADHS16-162406) till PTR. WA har fått förbi stöd från en pre forskarnivå utnämning till ett nationellt institut för hälsa utbildning bidrag (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?. AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
