En enkel og reproduserbar metode å forberede membran prøver fra ferske isolert rotte hjernen Microvessels
Summary
Her, er en metode for isolering av rotte hjernen microvessels og for utarbeidelse av membran prøver beskrevet. Denne protokollen har klare fordelen av å produsere beriket microvessel prøver med akseptabel protein gi fra enkelte dyr. Eksempler kan deretter brukes for robust protein analyser på hjernen mikrovaskulær endotelet.
Abstract
Blod – hjerne barrieren (BBB) er en dynamisk barrier vev som svarer til ulike patofysiologiske og farmakologiske stimuli. Slike endringer som følge av disse stimuli kan sterkt modulerer narkotika-leveranser til hjernen og dermed forårsake betydelige utfordringer i behandlingen av sentralnervesystemet (CNS) sykdommer. Mange BBB endringer som påvirker farmakoterapi, innebære proteiner som er lokalisert og uttrykt på nivået av endotelceller. Slik kunnskap på BBB fysiologi i helse og sykdom har faktisk skapt betydelig interesse i studiet av disse membran proteiner. Fra et grunnleggende vitenskap forskning ståsted innebærer dette et behov for en enkel men robust og reproduserbar metode for isolering av microvessels fra hjernevev høstet fra forsøksdyr. For å forberede membran prøver fra ferske isolert microvessels, er det viktig at prøven forberedelser være beriket i endotelceller, men begrenset i nærvær av andre celletyper av nevrovaskulære (dvs. astrocyttene, microglia, neurons, pericytes). En ekstra fordel er muligheten til å forberede prøver fra enkelte dyr for å fange den sanne variasjonen av protein uttrykk i en eksperimentell befolkning. I dette manuskriptet tilbys detaljer om en metode som benyttes for isolering av rotte hjernen microvessels og forberedelse av membran prøver. Microvessel berikelse, fra prøver avledet, oppnås ved hjelp av fire sentrifugering trinn der dekstran er inkludert i prøven bufferen. Denne protokollen kan lett tilpasses av andre laboratorier for sine egne spesifikke applikasjoner. Prøver fra denne protokollen har vist å gi robust prøvedata fra protein analyse eksperimenter som kan betydelig hjelpe forståelsen av BBB svar på fysiologiske patofysiologiske og farmakologiske stimuli.
Introduction
Blod – hjerne barrieren (BBB) finnes på grensesnittet mellom sentralnervesystemet (CNS) og systemisk sirkulasjonen og spiller en viktig rolle i vedlikehold av hjernen homeostase. Spesielt BBB funksjonene til nøyaktig kontroll stoff konsentrasjoner i hjernen ekstracellulære væske og effektivt levere disse næringsstoffer som kreves av hjernevev for å oppfylle betydelig metabolic kravene av CNS1. Disse rollene innebærer at BBB, som finnes hovedsakelig i nivået av mikrovaskulær endothelial celle, må ha separate mekanismer som gjør at noen stoffer til hjernen parenchyma samtidig at potensielt skadelige xenobiotics ikke samle. Faktisk hjernen mikrovaskulær endotelceller er ikke fenestrated og viser begrenset pinocytosis, som sikrer mangel på ikke-selektive permeabilitet2. I tillegg express hjernen microvessel endotelceller stramt junction og adherens krysset proteiner som fungerer til en fysisk “forsegle” mellom tilstøtende endotelceller og sterkt begrense paracellular spredning av blodbårne stoffer i hjernen parenchyma. Faktisk krever selektiv permeabilitet av endogene og eksogene stoffer funksjonelle uttrykk for opptak og middelklasseinnbyggere transportører3. Samlet, stramt veikryss, adherens veikryss og transportører jobber sammen å opprettholde de unike barriereegenskaper av BBB.
BBB er en dynamisk barriere som svarer til fysiologiske patofysiologiske og farmakologiske stimuli. For eksempel har hypoksi/reoxygenation stress blitt vist å modulere uttrykk for kritiske tett krysset proteiner (dvs. occludin, zonulae occluden-1 (ZO-1)), som er forbundet med økt paracellular permeabilitet til vaskulær markører slik som sukrose4,5,6. Lignende observasjoner gjort i BBB i innstillingen for traumatisk brain skader7 og eksterne inflammatorisk smerte8,9. Disse samme sykdommer kan også modulerer transportmekanismer BBB10,11,12,13,14. Faktisk, hypoksi/reoxygenation skade forbedrer funksjonelle uttrykk for organisk anion transport polypeptid 1a4 (Oatp1a4) på BBB, som kan føre til betydelige økninger i blod-til-hjerne transport av bestemte Oatp transport underlag slik taurocholate og atorvastatin13. BBB egenskaper kan også endres ved farmakoterapi, en mekanisme som kan danne grunnlag for både dyptgripende endringer i stoffet effektiviteten i hjernen og for narkotika-interaksjoner. For eksempel Paracetamol mål kjernefysiske reseptor signalnettverk mekanismer i hjernen mikrovaskulær endotelceller, øker funksjonelle uttrykk for den kritiske middelklasseinnbyggere transporter P-glykoprotein (P-gp) og endrer tidsavhengige analgesi gitt av morfin, transportere en opioid smertestillende medikament og etablerte P-gp substrat15. En grundig forståelse av BBB endringer, som kan være forårsaket av sykdommer eller narkotika, krever også identifikasjon og karakterisering av spesifikke regulatoriske mekanismene som styrer disse endringene. Faktisk diskret signalveier er blitt identifisert i hjernen mikrovaskulær endotelceller som kontrollerer molekylær uttrykk for tett krysset proteiner16,17 og transportører15, 18,19. Sammen indikerer disse observasjonene at komplekse molekylær veier er involvert i regulering av BBB stramt veikryss og transportører i både helse og sykdom.
En viktig utfordring i studiet av BBB er den absolutte kravet til en enkel og effektiv metode for isolering av microvessels fra hjernevev forsøksdyr og påfølgende forberedelse av membran prøver. Disse prøvene må være forberedt slik at de er både beriket i hjernen mikrovaskulær endotelceller og begrenset i nærvær av andre celletyper. Over de siste årene, har flere metoder for isolering av microvasculature fra gnager hjernen rapportert i vitenskapelig litteratur13,20,21,22. Denne artikkelen beskriver en enkel, robust, og reproduserbar metode for isolering av microvessels fra rotte hjerne og utarbeidelse av endothelial membran-beriket prøver som kan brukes til analyse av protein uttrykk. En fordel med denne microvessel isolasjon protokollen er muligheten til å få prøve forberedelser av høy kvalitet og med tilstrekkelig protein avkastning fra en individuell eksperimentelle dyr. Dette gjør at hensynet til Inter dyr variasjon i protein uttrykk. Slike forskudd i denne protokollen har mye bedre robusthet av BBB studier fordi over estimering, eller under estimering sanne omfanget av protein endringer på BBB nå kan unngås. I tillegg gir inkludering av flere sentrifugering trinn med dekstran forbedret anriking av microvessels i eksperimentelle prøver samtidig fremme fjerning av uønskede mobilnettet bestanddeler som neurons.
Protocol
Representative Results
Discussion
En enkel og effektiv metode for å forberede membran protein prøver fra microvessels fersk isolert fra rotte hjernevev er beskrevet i denne artikkelen. Flere tilnærminger for isolering av rotte hjernen microvessels og/eller generering av membran preparater fra isolert microvasculature er rapportert i litteraturen13,20,21,22 , 24. selv om microvessel isolasjo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R01-NS084941) og Arizona biomedisinsk forskning Commission (ADHS16-162406) til PTR. WA fått forbi støtte fra en pre avtale til nasjonale institutter for helse opplæring stipend (T32-HL007249).
Materials
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | #P8340 | Component of brain microvessel buffer |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Component of brain microvessel buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Component of brain microvessel buffer |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Component of brain microvessel buffer |
| Dextran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma |
| Zetamine | MWI Animal Health | #501072 | General anesthetic |
| Xylazine | Western Medical Supply | #5530 | General anesthetic |
| 0.9% saline solution | Western Medical Supply | N/A | General anesthetic diluent |
| Filter Paper (12.5 cm diameter) | VWR | #28320-100 | Used for removal of meninges from brain tissue |
| Centrifuge Tubes | Sarstedt | #60.540.386 | Disposable tubes used for dextran centrifugation steps |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay | ThermoFisher Scientific | #23236 | Measurement of protein concentration in membrane preparations |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Required for homogenization of samples |
| 10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder | DWK Life Sciences | #358039 | Required for homogenization of samples |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | #H1758 | Required for pH adjustment of buffers |
| Bovine Serum Albumin | ThermoFisher Scientific | #23210 | Protein standard for Bradford Assay |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | #91100-12 | Used for dissection of brain tissue |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Used for opening skull to isolate brain |
| 50 ml conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | #352070 | Used for collection of brain tissue following isolation |
| Glass Pasteur Pipets | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Used for aspiration of cellular debris following dextran spins |
| Ethanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | #459836 | Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | #41121703 | Used for ultracentrifugation of samples |
References
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke. J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802 (2017).
- Ronaldson, P. T., Davis, T. P. Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury. Brain Res. 1623, 39-52 (2015).
- Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).
- McCaffrey, G., et al. Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress. J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).
- Lochhead, J. J., et al. Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).
- Lucke-Wold, B. P., et al. Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury. Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).
- Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier. Brain Res. , 6-13 (2008).
- Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
- Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
- Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).
- Pop, V., et al. Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).
- Thompson, B. J., et al. Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).
- Tome, M. E., et al. P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).
- Slosky, L. M., et al. Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism. Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Yu, H., et al. Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells. Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).
- Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor. J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).
- Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
- Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain. Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).
- Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).
- McCaffrey, G., et al. Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo. J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).
- Brzica, H., et al. The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences. Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).
- Ronaldson, P. T., Bendayan, R. HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells. J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).
- Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran. J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
- Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?. AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).
