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Genetics

Axée sur la biotine Pulldown dosage à Validate ARNm cibles cellulaires miARN

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/57786
, , ,
1School of Biotechnology,Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology,Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

Ce rapport décrit une méthode rapide et fiable pour la validation de cibles ARNm des miARN cellulaire. La méthode utilise biotinylé synthétique basé sur Locked Nucleic Acid LNA miRNA imite pour capturer les cibles ARNm. Par la suite, streptavidine des billes magnétiques travaillent à menu déroulant la cible ADN messagère pour la quantification par qPCR polymerase chain reaction.

Abstract

MicroARN (miARN) sont une classe de petits ARN non codants qui post-traductionnelle régulent l’expression des gènes cellulaires. MiARN et la lier à la région 3′ non traduite (UTR) de cibler les ARNm à inhiber la traduction des protéines ou dans certains cas entraîner une dégradation des ARNm. La liaison de la miRNA pour la région 3′ UTR de la cible qu’adn messagère est médié par une séquence de graine de nucléotides de 2 à 8 à l’extrémité 5′ de miRNA. Alors que le rôle des miARN comme molécules régulatrices cellulaires est bien établi, identification de l’ARNm cible avec pertinence fonctionnelle demeure un défi. Outils bioinformatiques ont été utilisées pour prédire les séquences au sein de la région 3′ UTR des ARNm comme des cibles potentielles pour la liaison de miRNA. Ces outils ont également été utilisés pour déterminer la conservation évolutive de telles séquences entre espèces apparentées pour tenter de prédire le rôle fonctionnel. Cependant, ces méthodes de calcul souvent génèrent des faux positifs et se limitent à prévoir canonique interaction entre l’ARNm et miRNA. Par conséquent, les procédures expérimentales qui mesurent une liaison directe de miRNA vers sa cible d’ARNm sont nécessaires pour établir des interaction fonctionnelle. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode sensible pour valider une interaction directe entre le cellulaire miARN miR-125 b et les 3′ UTR de PARP-1 ARNm. Nous élaborons un protocole dans lequel mimétiques synthétiques biotinylé-miRNA ont été transfectés dans des cellules de mammifères et le complexe de miRNA-ARNm dans le lysat cellulaire a été tiré vers le bas avec la Streptavidine des billes magnétiques. Enfin, la cible qu’adn messagère dans la complexe d’acides nucléiques tiré vers le bas a été quantifiée à l’aide d’une stratégie axée sur le qPCR.

Introduction

MicroARN (miARN) est de petite taille non-coding RNAs qui régulent négativement protein expression1. Précurseurs de miRNA résident en grappes à travers de nombreuses régions du génome, plus fréquemment dans les régions intergéniques et les introns de2,de gènes codant pour des protéines3. Biogenèse des miARN impliquent la transcription de la pri-miARN de miRNA-codage gènes4. Le pri-miARN subissent un traitement séquentiel, dans le noyau, puis dans le cytoplasme pour produire seul brin miARN matures4,5. Par la suite, les miARN matures est incorporés dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC) : un complexe de protéine-ARN de multimères qui comprend un membre de la famille Argonaute de protéines pour cible reconnaissance4,5, 6,7. MiARN matures dans le complexe RISC principalement se lie à la région 3′ UTR de cibles ARNm8,9,10 , mais peut également lier occasionnellement dans le codage et la région 5′ UTR des ARNm10,11 . La liaison du miARN à l’ARNm des séquences résultats translationnelle silencieux12,13,14 et dans certains cas de déstabilisation ARNm15. Puisqu’un seul miRNA peut cibler plusieurs ARNm, ces molécules régulatrices sont impliqués dans presque tous les processus cellulaires et ont été impliqués dans diverses maladies conditions16,17,18.

Compréhension détaillée de comment les miARN réglemente voies cellulaires exige une identification de l’ARNm cible. Il existe plusieurs plates-formes de bio-informatique prédire les processus putatif des interactions19,20. Ces prédictions s’appuient sur la parfaite Watson-Crick base appariement entre la séquence 2 – 8 graines des nucléotides de la miRNA et une séquence complémentaire au sein de la cible ADN messagère4,21. En outre, ces outils génèrent une structure secondaire du processus duplex, calculer les paramètres thermodynamiques de cette interaction moléculaire et voir la conservation des sites de liaison à travers les espèces afin d’améliorer la pertinence fonctionnelle de la cible prédiction. Malheureusement, ces outils ont également la limitation de la prédiction de faux objectifs faisait positives à un taux très élevé (~ 27 – 70 %)15,22. Plus important encore, ces plates-formes en silico ne reconnaissent pas les interactions non-canoniques des miARN avec leurs cibles23. Par conséquent, ces analyses prédictives sont souvent combinées avec des méthodes expérimentales pour valider les objectifs pertinents sur le plan fonctionnel.

Plusieurs approches ont été développées afin de valider expérimentalement les interactions des processus. Les expériences génétiques à l’aide d’imitations de miRNA, éponges et inhibiteurs qui modifient les niveaux des miARN dans la cellule fournissent des indices pour son effet régulateur sur la cible gene expression24,25,26. En outre, journaliste basé à dosages par co transfection d’un clone contenant la région 3′ UTR de l’imite de miRNA et de l’ARNm cible ou inhibiteurs en cellules de fournissent la preuve de la fonction régulatrice des miARN26. Bien que ces méthodes sont essentielles étudier la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes de miARN, transfection efficacité et pleotropic effets des altérations cellulaires miRNA niveaux sont les principales limites de ces approches génétiques23, 26. Par conséquent, les méthodes biochimiques complémentaires qui sonde l’interaction directe entre les miARN et sa cible sont employés afin de mieux comprendre le fonctionnement cellulaire des miARN.

Une méthode couramment utilisée pour étudier l’interaction directe entre les miARN et sa cible est l’immunoprécipitation des complexes le RISC, suivie par la détection d’ARNm cible dans le complexe de27,28,,29,30 . Récemment, une méthode améliorée de piège RISC était également utilisée pour identifier les cibles de miRNA ; Il est couplé stabilisation des cibles dans les intermédiaires de RISC-miRNA-ARNm à la purification des cibles de l’ARNm. Cependant, ces methodsface les défis inhérents des interactions non spécifiques entre les ARN et la liaison à l’ARN des protéines qui sont habituellement séparés par compartiments cellulaires31,32. En outre, ces tests dépendent de la présence de la protéine AGO2 pour l’immunoprécipitation du complexe RISC33. AGO2 n’étant pas le seul argonaute de médier les interactions des processus efficaces, exclusion des autres argonautes pourrait conduire à des résultats biaisés34. Par conséquent, des stratégies alternatives sont nécessaires pour étudier la liaison directe de miRNA d’ARNm.

Dans ce rapport, nous élaborons une approche en une seule étape pour sonder une interaction directe entre un miRNA et sa cible ADN messagère. Tout d’abord, 3′ biotinylated verrouillé d’acide nucléique (LNA) miRNA imite est transfectés dans des cellules de mammifères. Ensuite, le processus complexe dans le lysat cellulaire est capturées à l’aide de billes magnétiques de streptavidine enduite. La cible de l’ARNm liée à sa complémentaire miRNA est quantifiée à l’aide de qPCR.

Protocol

1. la transfection de 3′-biotinylé miRNA Remarque : Effectuez les opérations suivantes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile. Semences 4 x 10,5-5 x 105 HEK-293 t cellules / puits dans 2 mL d’achever modifié Eagle (DMEM de Dulbecco) [DMEM additionné de 10 % de sérum foetal bovin (FBS) et 1 x antibiotique strep-Pen]. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO2 pendant la nuit. Le lendemain, véri…

Representative Results

MiARN réglemente les processus cellulaires en se liant à l’ARNm cible. Identification des cibles ARNm sont donc une clé pour comprendre le fonctionnement du miRNA. Ici, nous élaborons une méthode pour identifier les cibles ARNm de miRNA cellulaire. Ce protocole est adapté à partir de Wani et al. 35 avec la modification d’utilisant biotinylé axée sur la LNA miRNA imite à menu déroulant cibles ARNm. L’utilisation des oligonucléotides axée …

Discussion

Identification de cibles ARNm des miARN cellulaire est importante pour comprendre leur fonction régulatrice. Plusieurs outils informatiques sont utilisés pour prédire des cibles fondées sur la complémentarité de séquence de semences et de la conservation de cible séquences19,20. Bien que ces outils sont utiles, ils peuvent générer des niveaux élevés de faux positifs et faux négatifs. Par conséquent, ces prédictions sont couplées avec des méthodes…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (NIH) subventions DA037779 (à J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 et MD007586 (au C.D.). Le travail a été également soutenu par la RCMI Grant G12MD007586, les Vanderbilt CSTC Grant UL1RR024975, le centre de recherche translationnelle Meharry (MeTRC) CSTC accorde (U54 RR026140 de RRRNC/NIH, le U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH et le centre du Tennessee pour le sida Recherche (P30 AI110527).

Materials

Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D
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References

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Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).
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