JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/57786
, , ,
1School of Biotechnology,Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology,Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Abstract

MikroRNA (miRNAs) bir post-transcriptionally hücresel gen ekspresyonu düzenleyen küçük kodlamayan RNA’ların sınıfıdır. MiRNAs bağlama 3′ çevrilmeyen bölgesi (UTR) mRNA protein çeviri inhibe veya bazı durumlarda mRNA düşmesine yol için hedef. MiRNA için 3′ UTR tarafından 2 – 8 nükleotid tohum dizisi sonunda 5′ miRNA aracılı mRNA hedefinin bağlama. Hücresel düzenleyici molekülleri miRNAs rolünü iyi kurulmuş olsa da, fonksiyonel alaka ile hedef mRNA tanımlaması bir meydan okuma olarak kalır. Bioinformatic Araçlar içinde 3′ UTR mRNA’ların, dizileri miRNA bağlama için potansiyel hedef olarak tahmin etmek için istihdam edilmiştir. Bu araçlar aynı zamanda işlevsel rolü tahmin etmek için bir girişim böyle dizileri akraba türler arasında evrimsel korunması belirlemek için kullanılmıştır. Ancak, bu hesaplama yöntemleri kez yanlış pozitif sonuçlar üretmek ve kurallı etkileşim miRNA ve mRNA arasında öngörülen biçilen için sınırlıdır. Bu nedenle, miRNA mRNA hedefine için doğrudan bağlama ölçmek deneysel fonksiyonel etkileşim kurmak için gerekli işlemlerdir. Bu raporda, hücresel miRNA miR-125b ve 3′ UTR PARP-1 mRNA arasında doğrudan etkileşim doğrulamak için hassas bir yöntemi açıklanmaktadır. Sentetik biotinylated-miRNA taklit eder memeli hücre içine transfected ve cep lysate da miRNA-mRNA komplekse streptavidin kaplı manyetik boncuklar ile indirilmiş bir protokol ayrıntılı. Son olarak, hedef mRNA çekti aşağı nükleik asit karmaşık bir qPCR tabanlı strateji kullanarak sayısal.

Introduction

MikroRNA (miRNAs) küçük olumsuz protein ifade1düzenleyen RNA’ların kodlamayan. MiRNA nın kümeleri aracılığıyla intergenic bölgeler ve intron protein kodlayıcı genlerin2,3içinde en sık genom sahip pek çok bölge yer alır. MiRNAs Biyogenez dahil PRI-miRNAs miRNA kodlama, transkripsiyon genler4. PRI miRNAs sıralı işleme, ilk çekirdeği ve daha sonra tek telli olgun miRNAs4,5oluşturmak için sonra sitoplazmaya geçmesi. Daha sonra olgun miRNAs RNA-induced silencing tesisin (RISC) dahil edilmiştir: hedef tanıma4,5, proteinlerin Argonaute ailesinin bir üyesini içerir bir multimeric protein-RNA kompleksi 6,7. Olgun miRNAs karmaşık RISC ağırlıklı olarak 3′ UTR hedef mRNA’ların8,9,10 bağlamak ama de zaman zaman kodlama ve mRNA10,11 5′ UTR bölgesinde bağlayabilirsiniz . MiRNA mRNA için bağlama sonuçları translasyonel susturmak12,13,14 ve bazı durumlarda mRNA istikrarsızlık15diziler. Bir tek miRNA birçok mRNA’ların hedefleyebilirsiniz düzenleyici bu moleküller hemen hemen her hücresel sürecine dahil ve çeşitli hastalık koşulları da16,17,18karıştığı olmuştur.

Detaylı anlayış nasıl miRNAs hücresel yolları düzenleyen hedef mRNA’ların tanımlaması gerekir. Birden çok Biyoinformatik platform sözde miRNA:mRNA etkileşimleri19,20tahmin etmek kullanılabilir. Bu tahminler mükemmel Watson-Crick baz miRNA 2 – 8 nükleotit tohum sırasını ve hedef mRNA4,21içinde tamamlayıcı bir dizini arasında eşleşmesi üzerinde güveniyor. Buna ek olarak, bu araçlar miRNA:mRNA çift yönlü ikincil yapısını oluşturmak, bu moleküler etkileşim termodinamik parametreler hesaplamak ve bağlayıcı siteleri korunması hedef fonksiyonel alaka geliştirmek için türler arasında göstermek tahmin. Ne yazık ki, bu araçlar aynı zamanda yanlış pozitif hedeflerin çok yüksek oranda (% ~ 27 – 70)15,22tahmin sınırlaması var. En önemlisi, bu silico platformlar miRNAs kanonik olmayan etkileşimleri onların hedefleri23ile tanımak için başarısız. Bu nedenle, böyle akıllı analizleri kez işlevsel olarak ilgili hedefleri doğrulama için deneysel yöntemler ile birleştirilir.

Birden fazla yaklaşımları deneysel miRNA:mRNA etkileşim doğrulamak için geliştirilmiştir. MiRNA taklit eder kullanarak genetik deneyler sünger ve miRNAs hücre düzeyleri alter inhibitörleri hedef gen ifade24,25,26üzerindeki düzenleyici etkisi için ipuçları sağlayabilir. Ayrıca, muhabir deneyleri 3′ UTR bölgesinin hedef mRNA ve miRNA taklit eder içeren bir klonu Co transfection ile alan veya hücrelere inhibitörleri miRNAs26düzenleyici fonksiyonu kanıtı sağlamak. Bu yöntemlerin çoğu, düzenleme, gen ekspresyonu miRNAs tarafından çalışma için çok önemli olmakla birlikte, transfection verimlilik ve pleotropic hücresel miRNA düzeylerindeki değişiklikler etkilerini bu genetik yaklaşımlar23önemli sınırlamaları vardır, 26. Bu nedenle, miRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim sonda tamamlayıcı biyokimyasal yöntemleri miRNAs hücresel fonksiyonun daha iyi anlamak için istihdam edilmektedir.

MiRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim çalışmaya bir yaygın kullanılan RISC karmaşık ve karmaşık27,28,29,30 içinde mRNA hedef tespiti ve ardından immunoprecipitation yöntemidir . Son zamanlarda, bir Gelişmiş RISC tuzak Yöntemi ayrıca miRNA hedefleri tanımlamak için kullanılmıştır; RISC-miRNA-mRNA ara ürün içinde hedefler istikrar mRNA hedefleri arıtma ile çiftler. Ancak, bu methodsface non-spesifik etkileşim genellikle hücresel kompartmanlarda31,32tarafından ayrılmış RNA ve RNA bağlanıcı proteinler arasında içsel sorunları. Buna ek olarak, bu deneyleri için immunoprecipitation RISC karmaşık33AGO2 protein varlığını bağlıdır. Göz önüne alındığında bu AGO2 verimli miRNA:mRNA etkileşimlerin arabuluculuk sadece argonaute değil, diğer argonautes dışlanması için önyargılı sonuçları34neden olabilir. Bu nedenle, alternatif stratejileri miRNA mRNA için doğrudan bağlama çalışmaya ihtiyaç vardır.

Bu raporda, biz bir miRNA ve hedefine arasında doğrudan etkileşim problama için bir tek adımlı yaklaşım ayrıntılı mRNA. İlk olarak, 3′ biotinylated kilitli nükleik asit (LNA) miRNA taklit eder memeli hücre içine transfected. Sonra miRNA:mRNA cep lysate karmaşık streptavidin kaplı manyetik boncuklar kullanarak yakalanır. Onun tamamlayıcı miRNA bağlı mRNA hedef qPCR kullanarak sayılabilir.

Protocol

1. 3′-biotinylated miRNA transfection Not: bir steril laminar akış başlık içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin. 2 mL bir kuyu başına tohum 4 x 105–5 x 105 HEK-293T hücre Dulbecco’nın modifiye kartal Orta (DMEM) [DMEM % 10 Fetal Sığır serum (FBS) ve 1 x kalem-strep antibiyotik ile] tamamlayın. 37 ° C, % 5 CO2 gecede ayarla bir kuluçka hücrelerde kültür. Ertesi gün, sağlık ve bağlılık hafif bir mikroskop al…

Representative Results

MiRNAs hedef mRNA’ların bağlama yaparak hücresel işlemleri düzenler. Bu nedenle, tanımlayıcı mRNA miRNA işlevini anlamak için bir anahtar hedefleridir. Burada hücresel miRNA mRNA hedefi tanımlamak için bir yöntem ayrıntılı. Bu iletişim kuralı Wani ve ark. adapte 35 biotinylated LNA tabanlı miRNA taklit eder için açılan kullanarak değişiklik ile mRNA hedef. LNA tabanlı oligonükleotid taklit eder özgüllük hedef bağlama değişt…

Discussion

Hücresel miRNAs mRNA hedefleri tanımlaması düzenleyici işlevleri anlamak için önemlidir. Birkaç hesaplama araçları tohum sıra tamamlayıcılık ve koruma hedef sıraları19,20temel hedeflerini tahmin etmek için istihdam edilmektedir. Bu araçları değerli olmasına rağmen yüksek düzeyde yanlış pozitif ve yanlış negatifleri oluşturabilirsiniz. Bu nedenle, bu tahminler ile onların anılan sıraya göre hedefler27,<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser kısmen ulusal kurumları sağlık (NIH) hibe DA037779 (için J.P.), tarafından desteklenen DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 ve MD007586 (CD için). Çalışma Ayrıca RCMI Grant G12MD007586 Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975 tarafından desteklenmiştir Meharry Translational Araştırma Merkezi (MeTRC) CTSA vermek (U54 RR026140 NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 NIMHD/NIH üzerinden ve AIDS Tennessee Merkezi Araştırma (P30 AI110527).

Materials

Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
  3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  5. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
  6. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
  7. Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
  8. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
  10. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
  11. Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5′-UTR and 3′-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
  12. Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
  13. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
  14. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
  15. Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
  16. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  17. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  18. Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
  19. Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
  20. Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
  21. Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
  22. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
  23. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
  24. Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
  25. Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
  26. Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
  27. Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
  28. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
  29. Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
  30. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
  31. Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
  32. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  33. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
  34. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
  35. Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
  36. Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents?. BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
  37. Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
  38. Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
  39. Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
  40. Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
  41. Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
  42. Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer’s disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
  43. Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
  44. Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
  45. Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3′-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
  46. Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
  47. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).

Tags

Biotinylated MiRNA MimicsMRNA TargetsPulldown AssayLocked Nucleic AcidsStreptavidin-coated Magnetic BeadsMiRNA-mRNA InteractionsMiRNA BiologyMiRNA Therapeutics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image