JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/57786
, , ,
1School of Biotechnology,Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology,Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

Abstract

מיקרו Rna (miRNAs) הם סוג של RNAs noncoding קטן המווסתים ביטוי גנים הסלולר post-transcriptionally. איגוד MiRNAs לאזור 3′ לא מתורגם (UTR) של יעד ה-mRNA לעכב תרגום חלבונים או במקרים מסוימים לגרום השפלה mRNA. הכריכה של miRNA 3′ UTR המטרה ש-mrna מתווך על ידי רצף 2 – 8 זרעים נוקלאוטיד בקצה 5′ של miRNA. בעוד תפקיד miRNAs כמו מולקולות התאית התקינה וותיקה, זיהוי של mRNAs המטרה עם רלוונטיות פונקציונלי נשאר אתגר. יש כבר מועסקים Bioinformatic כלים לחזות רצפים בטווח 3′ UTR של mRNAs בתור מטרות פוטנציאליות עבור איגוד miRNA. כלים אלה יש גם מנוצל כדי לקבוע שימור כזה רצפים בין מינים קרובים אבולוציונית בניסיון לחזות את תפקיד פונקציונלי. אולם, שיטות אלה לעיתים קרובות להפיק תוצאות חיוביות שגויות, מוגבלות לחיזוי הקנוני האינטראקציה בין miRNA ל- mRNA. לכן, הטיפול. הניסיוני המודדים איגוד ישירה של miRNA למטרה mRNA שלו נחוצים ליצור אינטראקציה פונקציונלית. בדו ח זה, אנו מתארים שיטה רגיש עבור אימות באינטראקציה ישירה בין הסלולר miRNA של מיר-125b את 3′ UTR של PARP-1 mRNA. אנו נרחיב על פרוטוקול שבו מחקה biotinylated סינתטי-miRNA היו transfected בתרבית של תאים, למתחם miRNA-mRNA הסלולר lysate היה משוך כלפי מטה עם מצופים streptavidin beads מגנטי. בסופו של דבר, המטרה ש-mrna של חומצות גרעין למטה הוציא מורכבים הייתה לכמת באמצעות אסטרטגיה מבוסס qPCR.

Introduction

מיקרו Rna (miRNAs) הם קטנים ללא קידוד RNAs המווסתים ביטוי חלבון1באופן שלילי. סימנים מקדימים של miRNA לשכון אשכולות דרך אזורים רבים של הגנום, בתדירות הגבוהה ביותר בתוך אזורים intergenic, אינטרונים של חלבונים גנים2,3. להן של miRNAs לערב שעתוק של פרי-miRNAs מ קידוד miRNA גנים4. פרי-miRNAs עוברים עיבוד סדרתי, תחילה בגרעין ואז בציטופלסמה כדי ליצור יחידה miRNAs בוגרת נטושים4,5. לאחר מכן, בוגרת miRNAs משולבים המתחם שתיקה RNA-induced (RISC): קומפלקס חלבונים-RNA multimeric הכולל חבר של משפחת Argonaute של חלבונים היעד זיהוי4,5, 6,7. בוגרת miRNAs ב- RISC מורכבות בעיקר לאגד 3′ UTR של היעד mRNAs8,9,10 אבל יכול גם לאגד מדי פעם את הקוד ובאזור 5′ UTR של mRNA10,11 . הכריכה של miRNA ל mRNA רצף תוצאות translational שתיקה12,13,14 וכמה תיקים mRNA הקשורה15. מאז miRNA יחיד יכול למקד mRNAs רבים, מולקולות אלה רגולטוריות מעורב כמעט בכל תהליך הסלולר, היו מעורבים שונים המחלה התנאים16,17,18.

ההבנה מפורט כיצד miRNAs להסדיר מסלולים סלולריים דורש זיהוי של mRNAs המטרה. פלטפורמות מרובות ביואינפורמטיקה זמינים לחזות miRNA:mRNA בשם אינטראקציות19,20. תחזיות אלה מסתמכים על ווטסון-קריק הבסיס זיווג מושלם בין 2-8 נוקלאוטיד זרע רצף miRNA רצף משלים בתוך ה mRNA היעד4,21. בנוסף, כלים אלה ליצור מבנה שניוני של דופלקס miRNA:mRNA, חישוב הפרמטרים התרמודינמית של אינטראקציה מולקולרית זו ולהראות שימור האתרים מחייב על פני מינים לשיפור פונקציונלי הרלוונטיות של המטרה חיזוי. למרבה הצער, כלים אלה יש גם המגבלה של חיזוי מטרות חיובי כוזב בקצב מאוד גבוה (~ 27 – 70%)15,22. והכי חשוב, פלטפורמות אלה סיליקו להיכשל לזהות את האינטראקציות קאנונית של miRNAs עם המטרות שלהם23. לכן, כזה הניתוחים חזוי משולבים לעתים קרובות עם שיטות נסיוניות כדי לאמת את המטרות באופן פונקציונלי.

גישות רבות פותחו לאימות השפעול האינטראקציה miRNA:mRNA. ניסויים גנטיים באמצעות miRNA מחקה, ספוגים, מעכבי שמשנות את רמות miRNAs בתא לספק רמזים על השפעתו הרגולציה על היעד גנים ביטוי24,25,26. בנוסף, כתב המבוסס על מבחני דרך שיתוף תרביות תאים של שיבוט המכיל 3′ UTR האזור של mRNA, miRNA מחקה היעד או מעכבי לתוך תאים לספק הוכחה של פונקציית רגולציה של miRNAs26. בעוד ששיטות אלה חיוני ללמוד post-transcriptional בקרת גנים מאת miRNAs, תרביות תאים pleotropic ויעילות תופעות של שינויים ברמות miRNA הסלולר הן מגבלות הגדולות של אלה גישות גנטיות23, 26. לכן, שיטות ביוכימיות משלימים בדיקה האינטראקציה הישירה בין miRNA לבין המטרה שלו הם מועסקים כדי להבין טוב יותר את תפקוד miRNAs הסלולר.

אחת השיטות בשימוש נרחב כדי ללמוד את האינטראקציה הישירה בין miRNA לבין המטרה שלו היא immunoprecipitation של מורכבות RISC ואחריו את הגילוי של mRNA היעד בתוך מתחם27,28,29,30 . לאחרונה, שיטה משופרת של מלכודת RISC היה מנוצל גם לזהות מטרות miRNA; זה זוגות ייצוב של יעדים בתוך intermediates RISC-miRNA-mRNA בטהרה של mRNA מטרות. עם זאת, אלה methodsface האתגרים הכרוכים שאינם ספציפיים אינטראקציות בין חלבונים RNA ו- RNA-איגוד אשר מובדלים בדרך כלל על ידי תאים סלולריים31,32. בנוסף, מבחני אלה תלויות הנוכחות של חלבון AGO2 עבור immunoprecipitation של קומפלקס RISC33. בהתחשב בכך AGO2 אינה argonaute רק לתווך אינטראקציות miRNA:mRNA יעיל, אי-הכללה של אחרים argonautes עלול להוביל מוטה תוצאות34. לכן, אסטרטגיות אלטרנטיביות נדרשים ללמוד איגוד ישירה של miRNA ל mRNA.

בדו ח זה, אנו נרחיב על גישה חד-שלבית דורשים בדיקה האינטראקציה הישירה בין miRNA המטרה שלו mRNA. ראשית, 3′ מחקה miRNA חומצת גרעין (מגבר קדם) של biotinylated נעול הם transfected בתרבית של תאים. לאחר מכן, miRNA:mRNA מתחם הסלולר lysate נתפס באמצעות beads מגנטי streptavidin מצופה. המטרה mRNA המאוגד שלו miRNA משלימים זה לכמת באמצעות qPCR.

Protocol

1. תרביות תאים של miRNA 3′-biotinylated הערה: בצע את השלבים הבאים בתוך תא סטרילי למינארי. זרע 4 x 105–5 x 105 HEK-293T תאים לכל טוב ב- 2 מ של השלם של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) [DMEM בתוספת 10% סרום עוברית שור (FBS) ו- 1 x עט-דלקת אנטיביוטיקה]. התרבות התאים בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלז…

Representative Results

MiRNAs לווסת תהליכים תאיים על-ידי איגוד אל היעד mRNAs. לכן, זיהוי מטרות mRNA הן מפתח כדי להבין את הפונקציה miRNA. כאן אנו נרחיב על שיטה לזיהוי mRNA היעד של miRNA הסלולר. פרוטוקול זה הוא ממאמרו של Wani. et al. 35 עם השינוי של ניצול biotinylated מחקה miRNA מבוססת מגבר קדם כדי הנפתח יעד ה-mRN…

Discussion

זיהוי של מטרות mRNA של הסלולר miRNAs חשוב להבנת תפקידם רגולטוריות. מספר כלים חישוביים מועסקים לחזות המטרות בהתבסס על זרע רצף משלימים את החסר ועל שימור היעד-רצפים-19,–20. כלים אלה אמנם יקר, הם יכולים ליצור רמות גבוהות של תוצאות false חיוביות והן שליליות כוזבות. לכן, תחז?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה חלקית על ידי הלאומית המכונים לבריאות (NIH) DA037779 מענקים (כדי ג’יי פי), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960, MD007586 (על הדיסק). העבודה גם נתמך על ידי G12MD007586 גרנט RCMI, UL1RR024975 גרנט CTSA ונדרבילט, מרכז המחקר Translational Meharry (MeTRC) CTSA הענק (RR026140 U54 NCRR/NIH, את MD007593 גרנט U54 מ NIMHD/NIH, מרכז טנסי לאיידס מחקר (P30 AI110527).

Materials

Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
  3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  5. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
  6. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
  7. Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
  8. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
  10. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
  11. Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5′-UTR and 3′-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
  12. Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
  13. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
  14. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
  15. Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
  16. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  17. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  18. Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
  19. Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
  20. Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
  21. Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
  22. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
  23. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
  24. Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
  25. Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
  26. Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
  27. Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
  28. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
  29. Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
  30. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
  31. Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
  32. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  33. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
  34. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
  35. Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
  36. Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents?. BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
  37. Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
  38. Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
  39. Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
  40. Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
  41. Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
  42. Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer’s disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
  43. Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
  44. Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
  45. Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3′-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
  46. Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
  47. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).

Tags

Biotinylated MiRNA MimicsMRNA TargetsPulldown AssayLocked Nucleic AcidsStreptavidin-coated Magnetic BeadsMiRNA-mRNA InteractionsMiRNA BiologyMiRNA Therapeutics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image