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Genetics

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/57786
, , ,
1School of Biotechnology,Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology,Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs não-codificante que regulam a expressão gênica celular post-transcriptionally. Os MiRNAs ligam a 3′ untranslated região (UTR) do alvo do mRNA para inibir a tradução de proteínas ou em alguns casos causar degradação do mRNA. A ligação do miRNA para o 3′ UTR do mRNA é mediada por uma sequência de semente 2 – 8 nucleotídeos na extremidade 5′ de miRNA de destino. Embora o papel dos miRNAs como moléculas reguladoras celulares está bem estabelecido, identificação dos mRNAs alvo com relevância funcional permanece um desafio. Ferramentas de Bioinformatic têm sido empregadas para prever sequências dentro a 3′ UTR de mRNAs como alvos potenciais para vinculação de miRNA. Essas ferramentas também têm sido utilizadas para determinar a conservação evolutiva de tais sequências entre espécies relacionadas na tentativa de prever o papel funcional. No entanto, estes métodos computacionais frequentemente geram resultados falso-positivos e limitam-se a prever canônica interação entre miRNA e mRNA. Portanto, procedimentos experimentais que medem a vinculação direta de miRNA ao seu alvo de mRNA são necessários para estabelecer a interação funcional. Neste relatório, nós descrevemos um método sensível para validar a interação direta entre o miRNA celular miR-125 e o 3′ UTR de PARP-1 mRNA. Elaboramos um protocolo em que imita biotinilado-miRNA sintético foram transfectadas em células de mamíferos e o complexo de miRNA-mRNA no celular lisado foi puxado para baixo com grânulos magnéticos streptavidin-revestido. Finalmente, o destino de que mRNA no ácido nucleico puxado para baixo complexo foi quantificada utilizando uma estratégia baseada em qPCR.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs que regulam negativamente a expressão de proteínas1não-codificante. Precursores de miRNA residem em clusters através de muitas regiões do genoma, mais frequentemente nas regiões intergênicas e intrões de2,de genes codificantes de proteínas3. Biogênese dos miRNAs envolvem a transcrição dos pri-miRNAs de miRNA-codificação de genes4. Os pri-miRNAs passam por processamento sequencial, primeiro no núcleo e em seguida no citoplasma para gerar o único encalhado miRNAs maduro4,5. Posteriormente, os maduros miRNAs são incorporados o complexo silencioso induzido por RNA (RISC): um complexo proteína-RNA multiméricas que inclui um membro da família Argonaute de proteínas para alvo reconhecimento4,5, 6,7. MiRNAs maduros no complexo do RISC predominantemente ligar os 3′ UTR de alvo mRNAs8,9,10 , mas pode também ligar ocasionalmente na codificação e a região 5′ UTR do mRNA10,11 . A ligação de miRNA para o mRNA sequências resultados translacional silencioso12,13,14 e em alguns casos mRNA desestabilização15. Desde que um único miRNA pode direcionar muitos mRNAs, estas moléculas reguladoras estão envolvidas em quase todos os processos celulares e têm sido implicadas em várias doença condições16,17,18.

Conhecimento detalhado de como os miRNAs regulam vias celulares requer a identificação dos mRNAs alvo. Múltiplas plataformas de Bioinformática estão disponíveis para prever miRNA:mRNA putativo interações19,20. Estas previsões dependem de emparelhamento base em Watson-Crick perfeito entre a sequência de semente de nucleotídeos de 2 – 8 da miRNA e uma sequência complementar dentro do alvo do mRNA4,21. Além disso, essas ferramentas geram estrutura secundária de duplex miRNA:mRNA, calcular parâmetros termodinâmicos desta interação molecular e mostram conservação dos sítios de ligação entre espécies para melhorar a relevância funcional do alvo Previsão. Infelizmente, essas ferramentas também tem a limitação de prever alvos falsos positivos, em uma taxa muito alta (~ 27 – 70%)15,22. Mais importante ainda, essas plataformas em silico não reconhecem as interações não-canônicos de miRNAs com seus alvos de23. Portanto, essas análises preditivas são muitas vezes combinados com métodos experimentais para validar alvos funcionalmente relevantes.

Várias abordagens têm sido desenvolvidos para validar experimentalmente a interação miRNA:mRNA. Experimentos genéticos usando miRNA imita, esponjas e inibidores que alteram os níveis de miRNAs na célula fornecem pistas para seu efeito regulador sobre o alvo gene expressão24,25,26. Além disso, o repórter com base em ensaios através de transfeccao co de um clone que contém a região 3′ UTR de imita de mRNA e miRNA o alvo ou inibidores em células fornecem evidência da função reguladora de miRNAs26. Enquanto esses métodos são cruciais para estudar a regulação pós-transcricional da expressão gênica por miRNAs, transfecção eficiência e pleotropic os efeitos de alterações nos níveis de miRNA celulares são maiores limitações dessas abordagens genéticas23, 26. Portanto, métodos bioquímicos complementares que sondam a interação direta entre miRNA e seu alvo são empregados para entender melhor a função celular de miRNAs.

Um método amplamente utilizado para estudar a interação direta entre miRNA e seu alvo é a imunoprecipitação do complexo do RISC, seguido de detecção de alvo de mRNA dentro do complexo27,28,29,30 . Recentemente, um método melhorado de armadilha RISC também foi utilizado para identificar alvos de miRNA; -casais estabilização de alvos dentro os intermediários de RNAm-miRNA-RISC com a purificação dos alvos de mRNA. No entanto, estes methodsface os desafios inerentes de interacções não-específicas entre proteínas RNA e RNA-obrigatórias que geralmente são segregadas por compartimentos celulares31,32. Além disso, estes ensaios são dependentes da presença da proteína AGO2 para a imunoprecipitação do complexo RISC.33. Dado que AGO2 não é a única argonaute para mediar as interações miRNA:mRNA eficiente, exclusão de outras argonautes pode levar a resultados tendenciosos34. Portanto, estratégias alternativas são necessários para estudar a ligação direta de miRNA para mRNA.

Neste relatório, elaboramos uma abordagem de uma etapa para sondar a interação direta entre uma miRNA e seu alvo mRNA. Primeiro, a 3′ biotinilado trancado ácido nucleico (LNA) miRNA imita é transfectadas em células de mamíferos. Em seguida, o miRNA:mRNA complexo no celular lisado é capturada usando esferas magnéticas cobertas com estreptavidina. O alvo do mRNA vinculado a sua complementar miRNA é quantificado usando qPCR.

Protocol

1. a transfeccao de 3′-biotinilado miRNA Nota: Execute as seguintes etapas dentro de uma capa de estéril de fluxo laminar. Semente 4 x 105– 5 x 105 HEK-293T células por poço em 2 mL de completam modificado águia médio (DMEM de Dulbecco) [DMEM suplementado com 10% de soro Fetal bovino (FBS) e 1 x antibiótico caneta-estreptococos]. Cultura de células em uma incubadora que defina a 37 ° C, 5% CO2 durante a noite. No dia seguinte, veri…

Representative Results

Os MiRNAs regulam processos celulares, ligando-se alvo de mRNAs. Portanto, identificando alvos de mRNA são uma chave para entender a função de miRNA. Aqui, elaboramos um método para identificar o alvo do mRNA de miRNA celular. Este protocolo é adaptado do Wani et al 35 , com a modificação da utilizando biotinilado baseado no LNA miRNA imita a pulldown alvo do mRNA. O uso do LNA-baseado do oligonucleotide imita realça a especificidade da ligação d…

Discussion

Identificação de alvos de mRNA de miRNAs celulares é importante para a compreensão de sua função reguladora. Várias ferramentas computacionais são empregadas para prever alvos com base na complementaridade de sequência de sementes e conservação de alvo sequências19,20. Embora estas ferramentas são valiosas, podem gerar altos níveis de falsos positivos e falsos negativos. Portanto, estas previsões são acoplados com métodos experimentais, tais como…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (NIH) subvenções DA037779 (para J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 e MD007586 (para CD). O trabalho também foi apoiado pelo RCMI Grant G12MD007586, o Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, a Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA conceder (U54 RR026140 de NCRR/NIH, o U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH e o centro de Tennessee para AIDS Pesquisa (P30 AI110527).

Materials

Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D
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References

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Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).
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