Desplegable base de biotina de ensayo a validar mRNA miRNAs objetivos de celular
Summary
Este informe describe un método rápido y confiable para la validación de blancos del mRNA de miRNAs celular. Los usos del método biotinilado sintético basado en la LNA de ácido nucleico bloqueado miRNA imita para capturar objetivo mRNA. Posteriormente, se emplean bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina para telecine blanco mRNA para la cuantificación por reacción en cadena de polimerasa qPCR.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) son una clase de pequeños RNAs noncoding que regulan la expresión génica celular post-transcriptionally. MiRNAs atar a la región 3′ no traducida (UTR) de blanco mRNA para inhibir la traducción de la proteína o en algunos casos causar degradación del mRNA. La Unión de lo miRNA a los 3′ UTR del mRNA es mediada por una secuencia de semilla de 2 – 8 nucleótidos en el extremo 5′ de miRNA blanco. Mientras que el papel de miRNAs como moléculas reguladoras celulares está bien establecido, la identificación de los mRNAs de destino con relevancia funcional sigue siendo un desafío. Herramientas bioinformáticas han sido empleados para predecir las secuencias dentro de los 3′ UTR de los mRNAs como blancos potenciales para el atascamiento de miRNA. Estas herramientas también se han utilizado para determinar la conservación evolutiva de estas secuencias entre especies relacionadas en un intento de predecir el papel funcional. Sin embargo, estos métodos a menudo generan resultados falsos positivos y se limitan a predecir la interacción canónica entre miRNA y mRNA. Por lo tanto, los procedimientos experimentales que miden la Unión directa de miRNA a su objetivo de mRNA son necesarios establecer interacción funcional. En este informe, describimos un método sensible para la validación de interacción directa entre el celular miRNA miR-125b y 3′ UTR de PARP-1 mRNA. Elaboramos un protocolo en el que fueron transfectados imitadores sintéticos biotinilado-miRNA en células de mamíferos y el complejo de miRNA-mRNA en el lisado celular fue derribado con bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Por último, el objetivo de que mRNA en el ácido nucleico de tiró-abajo complejo se cuantificó usando una estrategia basada en qPCR.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) son pequeños no-codificación RNAs que regulan negativamente la expresión de proteína1. Precursores de miRNA residen en racimos a través de muchas regiones del genoma, más frecuentemente en las regiones intergénicas e intrones de genes proteína-codificación2,3. Biogénesis de miRNAs implican la transcripción de los pri-miRNAs de codificación miRNA genes4. Los pri-miRNAs son sometidos a procesamiento secuencial, primero en el núcleo y luego en el citoplasma para generar miRNAs maduros trenzado solo4,5. Posteriormente, los miRNAs maduros se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC): un complejo de ARN-proteína multimérica que incluye un miembro de la familia de Argonaute proteínas objetivo reconocimiento4,5, 6,7. MiRNAs maduros en el complejo RISC predominante se unen a los 3′ UTR de destino mRNAs8,9,10 pero de vez en cuando también puede enlazar en la codificación y la región 5′ UTR del mRNA10,11 . La Unión de miRNA en el mRNA secuencias resultados en traslacional silenciamiento12,13,14 y en algunos casos mRNA desestabilización15. Puesto que un único miRNA puede apuntar muchos mRNAs, estas moléculas reguladoras están involucradas en casi todos los procesos celulares y han sido implicadas en varias enfermedades condiciones16,17,18.
Comprensión detallada de cómo miRNAs regulan vías celulares requiere la identificación de los mRNAs de destino. Múltiples plataformas de Bioinformática están disponibles para predecir miRNA:mRNA supuesta interacciones19,20. Estas predicciones se basan en Watson-Crick base maridaje perfecto entre la secuencia de semilla de 2 – 8 nucleótidos de la miRNA y una secuencia complementaria dentro de la meta ARNm4,21. Además, estas herramientas generan estructura secundaria del miRNA:mRNA duplex, calcular parámetros termodinámicos de esta interacción molecular y mostrar la conservación de los sitios de unión a través de especies para mejorar la relevancia funcional de la meta predicción. Lamentablemente, estas herramientas también tienen la limitación de la predicción de falsos objetivos positivos a una tasa muy alta (~ 27 – 70%)15,22. Lo más importante, estas plataformas en silico incapaces de reconocer las interacciones no-canónico de miRNAs con sus objetivos23. Por lo tanto, tales análisis predictivos son a menudo combinados con métodos experimentales para validar objetivos funcionalmente relevantes.
Varios enfoques se han desarrollado para validar experimentalmente la interacción miRNA:mRNA. Experimentos genéticos con miRNA imitadores, esponjas e inhibidores que alteren los niveles de miRNAs en la célula proporcionan pistas por su efecto regulador sobre el objetivo gene expresión24,25,26. Además, reportero basado en análisis mediante la transfección de un clon que contiene la región 3′ UTR de los imitadores de mRNA y miRNA blanco o inhibidores en las células proporcionan pruebas de la función reguladora de miRNAs26. Mientras que estos métodos son cruciales para el estudio de la regulación postranscripcional de la expresión génica por miRNAs, transfección eficiencia y pleotropic efectos de las alteraciones en los niveles de miRNA de celular son principales limitaciones de estos enfoques genéticos23, 26. Por lo tanto, se emplean métodos bioquímicos complementarios que probe una interacción directa entre miRNA y su objetivo para entender mejor la función celular de miRNAs.
Un método ampliamente utilizado para el estudio de la interacción directa entre miRNA y su objetivo es la inmunoprecipitación de lo complejo RISC seguido por la detección de objetivo de mRNA en el complejo27,28,29,30 . Recientemente, un método mejorado de la trampa RISC también fue utilizado para identificar objetivos de miRNA; parejas estabilización de objetivos dentro de los intermedios de RISC-miRNA-mRNA con la purificación de las blancos del mRNA. Sin embargo, estos methodsface los desafíos inherentes de interacciones no específicas entre proteínas RNA y RNA-que ata que generalmente están separadas en compartimentos celulares31,32. Además, estos ensayos son dependientes en la presencia de antes2 proteínas por inmunoprecipitación de los complejos RISC33. Dado que antes2 no es el único argonaute para mediar las interacciones miRNA:mRNA eficiente, exclusión de otras argonautes podría conducir a resultados sesgados34. Por lo tanto, se necesitan estrategias alternativos para estudiar la Unión directa de miRNA al mRNA.
En este informe, elaboramos un enfoque de un solo paso para sondear la interacción directa entre un miRNA y su objetivo de mRNA. En primer lugar, 3′ ácidos nucleicos (LNA) biotinilado bloqueado miRNA imitadores son transfectados en células de mamíferos. Entonces, el miRNA:mRNA en el lisado celular es capturado mediante bolas magnéticas recubierta de estreptavidina. El objetivo de ARNm a su complementaria miRNA se cuantifica mediante qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identificación de dianas de mRNA de miRNAs celular es importante para la comprensión de su función reguladora. Se emplean varias herramientas computacionales para predecir objetivos basados en la complementariedad de secuencia de semillas y la conservación del destino secuencias19,20. Aunque estas herramientas son valiosas, pueden generar altos niveles de falsos positivos y falsos negativos. Por lo tanto, estas predicciones están acompañadas con métodos ex…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por donaciones de institutos nacionales de salud (NIH) DA037779 (a J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 y MD007586 (en C.D.). El trabajo fue apoyado también por el RCMI Grant G12MD007586, el Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, el centro de investigación traslacional de Meharry (MeTRC) CTSA conceder (U54 RR026140 de NCRR/NIH, el U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH y del centro de Tennessee para el SIDA Investigación (P30 AI110527).
Materials
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
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