Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과
Summary
이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) post-transcriptionally 세포 유전자 발현을 조절 하는 작은 noncoding RNAs의 클래스는. 3′ 번역된 (UTR)의 지역에 MiRNAs 바인딩 대상 mRNA 단백질 번역 억제 또는 어떤 경우에 mRNA 저하 될. 하는 3′ UTR mRNA miRNA의 5′ 끝에 2-8 뉴클레오티드 시드 순서에 의해 중재 대상의 miRNA의 바인딩. 세포질 규제 분자 miRNAs의 역할은 잘 설립, 기능적 관련성 대상 mRNAs의 식별 도전 남아 있다. Bioinformatic 도구 미르 바인딩에 대 한 잠재적인 대상으로 내는 3′ UTR mRNAs의 시퀀스 예측 하 고용 있다. 이러한 도구는 또한 관련된 종 중에서 같은 시퀀스의 진화 보존 기능 역할을 예측 하려고 결정 하 활용 되었습니다. 그러나, 이러한 계산 방법을 종종 거짓 긍정적인 결과 생성 하 고 미르와 mRNA 간의 정식 상호 작용을 예측으로 제한 됩니다. 따라서, 그것의 mRNA 표적에 미르의 직접 바인딩을 측정 실험 절차는 상호 작용 기능을 설정 하는 데 필요한. 이 보고서에서 우리는 셀룰러 미르 미르 125b와 3′ UTR의 PARP-1 mRNA 간의 직접적인 상호 작용의 유효성을 검사 하는 민감한 방법을 설명 합니다. 우리 정교한 프로토콜 있는 합성 biotinylated-미르 모방 되었다 포유류 세포로 페 하 고 미르 mRNA 복잡 한 세포 lysate에서 자석 구슬 streptavidin 입히는 내려 오게 되었다. 마지막으로, 대상 복잡 한 뽑아 다운 핵 산에서 mRNA 정량 기반 전략을 사용 하 여 계량 했다.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs)는 작은 비 코딩 RNAs 단백질 식1부정적인 통제. 미르의 선구자 단백질 코딩 유전자2,3의 introns 그리고 intergenic 지역 내 가장 자주 게놈의 많은 영역을 통해 클러스터에 상주합니다. MiRNA 인코딩에서 pri miRNAs의 전사를 포함 하는 miRNAs의 속 유전자4. Pri miRNAs는 순차 처리를, 그리고 단일 좌초 성숙한 miRNAs4,5를 생성 하는 세포질에서 핵에서 처음 받 다. 그 후, 성숙한 miRNAs RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 통합 하는: 대상 인식4,5, 단백질의 Argonaute 제품군의 구성원을 포함 하는 multimeric 단백질-RNA 복잡 6,7. 복잡 한 RISC에 성숙한 miRNAs는 주로 바인딩할는 3′ UTR 대상 mRNAs8,,910 의 하지만 가끔 코딩 및 mRNA10,11의 5′ UTR 영역에 바인딩할 수도 있습니다. . MiRNA에는 mRNA의 바인딩을 변환 입을12,,1314 및 일부 경우 mRNA 불안15결과 시퀀스. 하나의 miRNA는 많은 mRNAs를 타겟팅 할 수 있습니다, 이후 이러한 규제 분자 거의 모든 세포질 프로세스에 참여 하 고 다양 한 질병 상태16,,1718에 연루 되었습니다.
MiRNAs 세포 경로 조절 하는 방법의 자세한 이해 필요 대상 mRNAs의 식별을 합니다. 여러 생물 정보학 플랫폼 putative miRNA:mRNA 상호 작용19,20을 예측할 수 있습니다. 이러한 예측은 miRNA의 2-8 뉴클레오티드 시드 순서와 대상 mRNA4,21내 보완 시퀀스 사이의 완벽 한는 왓슨 크릭 기본 쌍에 의존 합니다. 또한, 이러한 도구 miRNA:mRNA 이중의 이차 구조를 생성,이 분자 상호 작용의 열역학 매개 변수를 계산 하 고 대상의 기능적 관련성을 향상 시키기 위해 종에 걸쳐 바인딩 사이트의 보존을 보여 예측입니다. 불행히도,이 도구는 또한 매우 높은 속도 (~ 27-70%)15,22거짓 긍정적인 목표를 예측의 한계가 있다. 가장 중요 한 것은, 이러한 철에 플랫폼 그들의 대상23miRNAs의 정식이 아닌 상호 작용을 인식 실패. 따라서, 이러한 예측 분석 기능 관련 목표를 확인 하는 실험 방법 종종 결합 됩니다.
여러 방법은 실험적으로 miRNA:mRNA 상호 작용을 확인 하기 위해 개발 되었습니다. 유전자 실험 미르 모방을 사용 하 여 스폰지와 억제제 셀에서 miRNAs의 레벨을 변경 하는 대상 유전자 식24,,2526에 규제의 효과 대 한 단서를 제공 합니다. 또한, 기자 대상 mRNA와 미르 모방의 3′ UTR 영역을 포함 하는 복제의 공동 transfection 통해 분석을 기반으로 또는 세포에 억제제 miRNAs26의 규제 기능의 증거를 제공. 이러한 방법은 miRNAs에 의해 유전자 발현의 post-transcriptional 레 귤 레이 션을 공부 하는 중요 한 동안, 셀룰러 미르 레벨에서 변경의 transfection 효율 및 pleotropic 효과 이러한 유전 접근23의 주요 한계 26. 따라서, miRNA와 표적 간의 직접적인 상호 작용을 조사 하는 보완 생화학 방법은 miRNAs의 세포질 기능을 더 나은 이해를 채용 합니다.
하나 널리 사용 되 miRNA와 표적 간의 직접적인 상호 작용을 공부 하 방법은 뒤에 복잡 한27,,2829,30 내 mRNA 대상의 검색 복잡 한 RISC의 immunoprecipitation . 최근, 향상 된 RISC 트랩 방법 또한 미르 대상;을 식별 하기 위해 이용 되었다 그것은 mRNA 대상의 정화와 RISC-미르-mRNA 중간체 내의 대상의 안정화 커플. 그러나,이 methodsface 일반적으로 세포질 구획31,32에 의해 차별 하는 RNA와 RNA 바인딩 단백질 사이 일반적인 상호 작용의 내재 도전. 또한, 이러한 분석 RISC 복잡 한33의 immunoprecipitation에 대 한 AGO2 단백질의 존재에 의존 하고있다. AGO2는 효율적인 miRNA:mRNA 상호 작용을 중재 하는 유일한 argonaute 하지, 다른 argonautes의 한쪽으로 치우친된 결과34발생할 수 있습니다. 따라서, 대체 전략 mRNA에 미르의 직접 바인딩 공부 필요 합니다.
이 보고서에서 우리는 miRNA 및 그 대상 간의 직접적인 상호 작용을 프로 빙에 대 한 1 단계 접근 정교한 mRNA. 첫째, 3′ biotinylated 잠겨 핵 산 (LNA) 미르 모방 포유류 세포로 페는. 그런 다음, 세포 lysate에 복잡 한 miRNA:mRNA 코팅 streptavidin 자석 비즈를 사용 하 여 캡처됩니다. 상호 보완적인 miRNA에 바인딩된 mRNA 대상 정량 Pcr를 사용 하 여 정량 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
세포질 miRNAs의 mRNA 표적 식별이 그들의 규제 기능을 이해 중요 합니다. 여러 계산 도구는 씨앗 시퀀스 complementarity 및 대상 시퀀스19,20의 보존에 따라 목표를 예측 하 고용 된다. 이 도구는 귀중 한, 비록 그들은 가양성 및 false 네거티브의 상부를 생성할 수 있습니다. 따라서, 이러한 예측은 복잡 하 고 복잡 한 miRNA:mRNA의 풀 다운 RISC 그들의 각각 목표<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 국립 보건원 (NIH) 보조금 DA037779 (일본)에 의해 부분적으로 지원 되었다 DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 및 MD007586 (C.D.)에. 작품 RCMI 그랜트 G12MD007586, 밴 더 빌 트 CTSA 그랜트 UL1RR024975에 의해 또한 지원 되었다 Meharry 들어가게 연구 센터 (MeTRC) CTSA 부여 (U54 NCRR/NIH, NIMHD/NIH에서 U54 그랜트 MD007593와 에이즈에 대 한 테네시 센터에서 RR026140 연구 (P30 AI110527)입니다.
Materials
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
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