На основе биотина пулдаун Assay для проверки mRNA цели сотовой адаптивной
Summary
В настоящем докладе описывается быстрый и надежный метод для проверки мРНК-мишеней клеточных адаптивной. Метод использует Мирна Locked LNA нуклеиновой кислоты на основе синтетических биотинилированным имитирует захватить цель мРНК. Впоследствии, с покрытием стрептавидина магнитные бусы используются для выпадающих целевой мРНК для количественной ПЦР полимеразной цепной реакции.
Abstract
МикроРНК (интерферирующим) являются класс малых некодирующей РНК, которые post-transcriptionally регулировать экспрессию клеточных генов. Интерферирующим привязку к 3′ непереведенные региона (утр) целевых мРНК ингибировать белков перевод или в некоторых случаях привести к деградации мРНК. Связывание Мирна с 3′ УТР цели, которую мРНК при посредничестве 2 – 8 нуклеотидной последовательности семян к 5′ концу Мирна. Хотя роль адаптивной как сотовой регуляторных молекул является хорошо организованной, идентификация целевого мРНК с функциональной значимости остается проблемой. Инструменты bioinformatic использовались для прогнозирования последовательностей в течение 3′ УТР мРНК как потенциальных объектов для привязки Мирна. Эти средства использовались также определить эволюционной сохранения таких последовательностей среди родственных видов в попытке предсказать функциональную роль. Однако эти вычислительные методы часто создавать ложных положительных результатов и ограничиваются прогнозирования канонические взаимодействие между Мирна и мРНК. Таким образом экспериментальные методы, измеряющих прямую привязку Мирна mRNA цели необходимы для создания функционального взаимодействия. В настоящем докладе мы описываем чувствительный метод для проверки прямого взаимодействия между сотовой микроРНК miR-125b и 3′ УТР ППА-1 мРНК. Мы разработать протокол, в котором синтетических биотинилированным miRNA имитирует были transfected в клетки млекопитающих и Мирна мРНК комплекс в lysate сотовых был потянул вниз с покрытием стрептавидина магнитные бусы. Наконец цель, которую мРНК в потянул вниз нуклеиновой кислоты комплекс был количественно с помощью стратегию на основе ПЦР.
Introduction
МикроРНК (интерферирующим) малы некодирующих РНК, которые негативно регулируют выражение протеина1. Предшественники микроРНК проживают в кластерах через многие регионы генома, наиболее часто в intergenic регионах и интронов белка кодирование генов2,3. Биогенеза интерферирующим включают транскрипции pri адаптивной от miRNA кодирование генов4. Pri адаптивной проходят последовательной обработки, сначала в ядре и затем в цитоплазме для создания единого мель Зрелые интерферирующим4,5. Впоследствии, Зрелые интерферирующим включены в РНК-комплекс (RISC): multimeric белка РНК комплекс, который включает в себя членом семьи Argonaute белков для целевых признание4,5, 6,7. Зрелые интерферирующим в RISC комплекс преимущественно привязку к 3′ УТР целевой mRNAs8,9,10 , но можно также привязать иногда кодирование и 5′ УТР регионе мРНК10,11 . Связывание Мирна к мРНК последовательностей результаты в трансляционной глушителей12,13,14 и в некоторых случаях мРНК дестабилизации15. Поскольку один Мирна можно ориентировать многие мРНК, эти регуляторные молекулы участвуют в почти каждый клеточных процессов и были вовлечены в различные болезни условия16,17,18.
Глубокое понимание как интерферирующим регулировать сотовой пути требует идентификации целевого мРНК. Биоинформатика платформ доступны прогнозировать предполагаемый miRNA:mRNA взаимодействия19,20. Эти предсказания полагаются на идеальный Уотсона-крика низкопробный спаривать между 2-8 семян нуклеотидной последовательности Мирна и взаимодополняющих последовательности в рамках целевой мРНК4,21. Кроме того эти инструменты создать вторичную структуру miRNA:mRNA дуплекс, расчет термодинамических параметров этого молекулярного взаимодействия и показать сохранения привязки сайтов различных видов для повышения функциональной значимости цели предсказание. К сожалению эти средства также имеют ограничение прогнозирования ложных положительных целей очень высокий уровень (~ 27 – 70%)15,22. Самое главное эти платформы в silico не признать неканонических взаимодействия интерферирующим с их цели23. Таким образом такой интеллектуальный анализ часто комбинируются с экспериментальные методы для проверки функционально соответствующих целей.
Были разработаны несколько подходов для экспериментально проверить miRNA:mRNA взаимодействия. Генетических экспериментов с использованием Мирна мимики, губки и ингибиторов, которые изменяют уровни интерферирующим в ячейке предоставляют ключи для его регулирования воздействия на25,24,выражение гена целевой26. Кроме того репортер на основе анализов через совместное трансфекции клона, содержащий 3′ УТР регионе целевой мРНК и Мирна имитирует или ингибиторов в клетки свидетельствуют о регулирующей функции интерферирующим26. Хотя эти методы имеют решающее значение для изучения post-transcriptional регуляции экспрессии генов, адаптивной, transfection эффективность и pleotropic эффекты изменений в клеточных Мирна уровнях являются основные ограничения этих генетических подходов23, 26. Таким образом взаимодополняющие биохимические методы, проверяющие прямое взаимодействие между Мирна и его цели работают лучше понять клетчатую функцию адаптивной.
Один широко используемый метод изучения прямое взаимодействие между Мирна и его целью является иммунопреципитации RISC комплекс следуют обнаружения mRNA цели в пределах комплекса27,28,29,30 . Недавно усовершенствованный метод ловушки RISC была также использована для выявления Мирна целей; Это пары стабилизации целей в рамках промежуточных RISC-miRNA мРНК с очисткой мРНК-мишеней. Однако эти methodsface присущие проблемы неспецифичные взаимодействия РНК и RNA-связывая протеинов, которые обычно разделяются на клеточном отсеков31,32. Кроме того эти анализы зависит от наличия давности2 белка для иммунопреципитации RISC комплекс33. Учитывая, что давности2 является не только argonaute для эффективного miRNA:mRNA взаимодействие, исключение других argonautes может привести к предвзятым результаты34. Таким образом альтернативные стратегии необходимы для изучения прямую привязку Мирна к мРНК.
В настоящем докладе, мы разрабатываем одноэтапный подход для проверки прямого взаимодействия между Мирна и его целевых мРНК. Во-первых 3′ биотинилированным заблокирован нуклеиновой кислоты (LNA) Мирна имитирует являются transfected в mammalian клетках. Затем miRNA:mRNA комплекс в lysate сотовых фиксируются с помощью магнитной бусины стрептавидина покрытием. Целевой мРНК, обязан ее дополнительных Мирна количественно с помощью ПЦР.
Protocol
Representative Results
Discussion
Определение мРНК-мишеней сотовой интерферирующим имеет важное значение для понимания их функции регулирования. Несколько вычислительных средств используются для прогнозирования цели, основанные на взаимодополняемости семян последовательности и сохранения целевого объекта послед?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается DA037779 национальных институтов здравоохранения (НИЗ) гранты (до Ю.П.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 и MD007586 (для ПД). Работа также была поддержана RCMI Грант G12MD007586, Вандербильт CTSA Грант UL1RR024975, Мехарри переводческая научно-исследовательский центр (MeTRC) CTSA Грант (U54 RR026140 от NCRR/низ, Грант MD007593 U54 от NIMHD/низ и Теннесси центр СПИДа Исследования (P30 AI110527).
Materials
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
References
- Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
- Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
- Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
- Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
- Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
- Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
- Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5′-UTR and 3′-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
- Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
- Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
- Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
- Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
- Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
- Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
- Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
- Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
- Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
- Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
- Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
- Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
- Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
- Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
- Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
- Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
- Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
- Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
- Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
- Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
- Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
- Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents?. BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
- Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
- Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
- Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
- Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
- Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
- Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer’s disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
- Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
- Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
- Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3′-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
- Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).
