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Genetics

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/57786
, , ,
1School of Biotechnology,Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology,Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Abstract

I microRNA (Mirna) sono una classe di piccoli RNA non codificanti che appaiamento regolano l’espressione genica cellulare. Mirna bind per la regione 3′ non tradotta (UTR) del bersaglio mRNA per inibire la traduzione della proteina o in alcuni casi causare la degradazione di mRNA. L’associazione del quieto al 3′ UTR del bersaglio che mRNA è mediato da una sequenza di seme del nucleotide di 2 – 8 all’estremità 5′ di miRNA. Mentre il ruolo dei miRNA come molecole regolatrici cellulari è ben consolidato, identificazione degli mRNA bersaglio con rilevanza funzionale rimane una sfida. Strumenti bioinformatici sono stati impiegati per prevedere sequenze all’interno di 3′ UTR degli mRNA come obiettivi potenziali per l’associazione di miRNA. Questi strumenti sono stati utilizzati anche per determinare la conservazione evolutiva di tali sequenze tra specie affini nel tentativo di prevedere il ruolo funzionale. Tuttavia, questi metodi computazionali spesso generano falsi positivi e sono limitati a predire canonica interazione tra miRNA e mRNA. Di conseguenza, le procedure sperimentali che misurano il legame diretto del miRNA al suo target di mRNA sono necessari da stabilire interazione funzionale. In questo rapporto, descriviamo un metodo sensibile per la convalida di interazione diretta tra i cellulari miRNA miR-125b e 3′ UTR di PARP-1 mRNA. Elaboriamo un protocollo in cui imita sintetico biotinilato-miRNA transfected nelle cellule di mammiferi e il complesso di miRNA-mRNA nel lisato cellulare è stato tirato con biglie magnetiche rivestite con streptavidina. Infine, la destinazione del che mRNA nel complesso dell’acido nucleico spostate verso il basso è stato quantificato utilizzando una strategia basata su qPCR.

Introduction

I microRNA (Mirna) sono piccoli RNA che regolano negativamente l’ espressione di proteina1non codificanti. Precursori di miRNA risiedono in cluster attraverso molte regioni del genoma, più frequentemente all’interno delle regioni intergeniche e introni di proteina-codificazione geni2,3. Biogenesi dei miRNA coinvolgono trascrizione dei pri-miRNA da miRNA-codifica geni4. I pri-miRNA sono sottoposti a elaborazione sequenziale, prima nel nucleo e nel citoplasma per generare singolo incagliato Mirna maturi4,5. Successivamente, i miRNA maturi sono incorporati il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC): una proteina-RNA multimerica complessa che include un membro della famiglia di proteine per destinazione riconoscimento4,5, Argonaute 6,7. Mirna maturi nel complesso RISC prevalentemente associare al 3′ UTR di destinazione mRNAs8,9,10 ma anche possono associare occasionalmente nella codificazione e la regione 5′ UTR del mRNA10,11 . L’associazione di miRNA per il mRNA sequenze risultati in traslazionale silenziamento12,13,14 e in alcuni casi mRNA destabilizzazione15. Poiché un singolo miRNA puoi indirizzare molti mRNA, queste molecole regolatrici sono coinvolte in quasi ogni processo cellulare e sono state implicate in varie malattie condizioni16,17,18.

Conoscenza dettagliata di come Mirna regolano vie cellulari richiede l’identificazione degli mRNA bersaglio. Sono disponibili per predire putativi miRNA:mRNA interazioni19,20più piattaforme di bioinformatica. Queste previsioni si basano su perfetto Watson-Crick appaiamento tra la sequenza di seme del nucleotide di 2 – 8 del quieto e una sequenza complementare entro il4,di mRNA target21. Inoltre, questi strumenti generano la struttura secondaria del duplex miRNA:mRNA, calcolano i parametri termodinamici di questa interazione molecolare e visualizza conservazione delle sedi del legame tra le specie per migliorare la rilevanza funzionale della destinazione Pronostico. Purtroppo, questi strumenti hanno anche la limitazione della predizione falsi obiettivi positivi a un tasso molto elevato (~ 27 – 70%)15,22. La cosa più importante, queste piattaforme in silico non riescono a riconoscere le interazioni non-canonica di Mirna con loro obiettivi23. Pertanto, tali analisi predittive sono spesso combinati con metodi sperimentali per convalidare funzionalmente rilevanti obiettivi.

Diversi approcci sono stati sviluppati per convalidare sperimentalmente l’interazione miRNA:mRNA. Esperimenti genetici utilizzando miRNA mimics, spugne e inibitori che alterano i livelli di miRNA nella cella forniscono indizi per suo effetto regolatore dal bersaglio gene espressione24,25,26. Inoltre, reporter basato su analisi tramite co-transfezione di un clone contenente la regione 3′ UTR di mimici di mRNA e miRNA la destinazione o inibitori in cellule forniscono la prova della funzione regolamentare di Mirna26. Mentre questi metodi sono fondamentali per studiare la regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica di Mirna, effetti di efficienza e pleotropic di transfezione delle alterazioni nei livelli di miRNA cellulare sono grossi limiti di questi approcci genetici23, 26. Di conseguenza, complementari metodi biochimici che sonda l’interazione diretta tra miRNA e l’obiettivo sono impiegati per comprendere meglio la funzione cellulare dei miRNA.

Un metodo ampiamente utilizzato per studiare l’interazione diretta tra miRNA e il suo obiettivo è immunoprecipitazione del complesso RISC seguito mediante l’individuazione del target di mRNA all’interno del complesso27,28,29,30 . Recentemente, un metodo migliorato di trappola RISC è stato utilizzato anche per identificare bersagli miRNA; si accoppia stabilizzazione degli obiettivi all’interno gli intermedi di RISC-miRNA-mRNA con la purificazione del mRNA bersaglio. Tuttavia, questi methodsface le sfide inerenti delle interazioni aspecifiche tra proteine RNA e RNA-binding che solitamente sono segregate da compartimenti cellulari31,32. Inoltre, queste analisi sono dipendente dalla presenza di proteine AGO2 per immunoprecipitazione del complesso RISC33. Dato che AGO2 non è l’unico argonaute per mediare interazioni miRNA:mRNA efficiente, l’esclusione di altri argonautes potrebbe portare a risultati biased34. Pertanto, strategie alternative sono necessari per studiare il legame diretto del miRNA a mRNA.

In questo rapporto, abbiamo elaborato un approccio One-Step per sondare l’interazione diretta tra un miRNA e l’obiettivo mRNA. In primo luogo, 3′ biotinilati bloccato dell’acido nucleico (LNA) miRNA imita transfected nelle cellule di mammiferi. Quindi, la miRNA:mRNA complesso nel lisato cellulare viene catturato utilizzando streptavidina biglie magnetiche. Il target di mRNA associato alla sua miRNA complementare è quantificato utilizzando qPCR.

Protocol

1. la transfezione di 3′-biotinylated miRNA Nota: Eseguire la procedura seguente all’interno di una cappa a flusso laminare sterile. Cellule di seme 4 x 105– 5 x 105 HEK 293T per pozzetto in 2 mL di completano per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco) [DMEM completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1 x antibiotico penna-strep]. Coltura le cellule in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 durante la notte. Il giorno successivo, controllare la…

Representative Results

Mirna regolano processi cellulari legandosi agli mRNA bersaglio. Di conseguenza, identificazione mRNA bersaglio è la chiave per capire la funzione di miRNA. Qui abbiamo elaborato un metodo per identificare target di mRNA di miRNA cellulare. Questo protocollo è adattato da Wani et al. 35 con la modifica dell’utilizzazione biotinilati basati su LNA miRNA imita di pulldown bersaglio mRNA. L’uso di base di LNA oligonucleotidi mimici migliora la specificità …

Discussion

Identificazione di mRNA target dei miRNA cellulari è importante per capire la loro funzione regolatrice. Diversi strumenti computazionali sono impiegati per prevedere obiettivi basati sulla complementarietà di sequenza di sementi e sulla conservazione di sequenze bersaglio19,20. Anche se questi strumenti sono utili, possono generare elevati livelli di falsi positivi e falsi negativi. Di conseguenza, queste previsioni sono accoppiate con metodi sperimentali qual…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni DA037779 (a J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 e MD007586 (a C.D.). Il lavoro è stato anche sostenuto dal RCMI Grant G12MD007586, i Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, centro di ricerca traduzione Meharry (MeTRC) CTSA concedere (U54 RR026140 da NCRR/NIH, il Grant MD007593 U54 da NIMHD/NIH e il Tennessee Center per AIDS Ricerca (P30 AI110527).

Materials

Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D
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References

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Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).
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