Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.
MicroRNAs (miRNAs) vormen een klasse van kleine noncoding RNAs die post-transcriptionally cellulaire genexpressie regelen. MiRNAs binden aan de 3′ niet-vertaalde regio (UTR) van target mRNA te remmen eiwit vertaling of in sommige gevallen leiden tot aantasting van het mRNA. De binding van de miRNA aan de 3-‘ UTR van het streefcijfer dat mRNA wordt gemedieerd door een 2 – 8 nucleotide zaad reeks eind 5’ miRNA. Terwijl de rol van miRNAs als cellulaire regelgevende moleculen goed ingeburgerd is, blijft identificatie van de target mRNAs met functionele relevantie een uitdaging. Bioinformatic hulpmiddelen zijn tewerkgesteld te voorspellen van reeksen binnen de 3-‘ UTR van mRNAs als doelwit voor miRNA bindend. Deze hulpprogramma’s zijn ook gebruikt om te bepalen van de evolutionaire instandhouding van dergelijke sequenties onder Verwante soorten in een poging om te voorspellen van functionele rol. Echter deze rekenmethoden vaak vals-positieve resultaten genereren en zijn beperkt tot het voorspellen van de canonieke interactie tussen miRNA en mRNA. Experimentele procedures die meten van directe binding van miRNA aan haar doelstelling van mRNA zijn daarom noodzakelijk vast te stellen functionele interactie. In dit verslag beschrijven we een gevoelige methode voor de validatie van de directe interactie tussen de cellulaire miRNA miR-125 ter en de 3’ UTR van PARP-1 mRNA. Wij werken een protocol waarin synthetische biotinyleerd-miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen en de miRNA-mRNA-complex in de cellulaire lysate werd gesloopt met streptavidine beklede magnetische kralen. Tot slot, het doel dat mRNA in de trok-down nucleic acid complex werd gekwantificeerd aan de hand van een qPCR gebaseerde strategie.
MicroRNAs (miRNAs) zijn klein niet-coderende RNAs die eiwit expressie1negatief te regelen. Precursoren van miRNA bevinden zich in clusters door vele regio’s van het genoom, vaakst binnen de intergenic regio’s en de introns van eiwit-codeert genen2,3. Biogenese van miRNAs betrekken transcriptie van de pri-miRNAs van miRNA-encoding genen4. De pri-miRNAs ondergaan sequentiële verwerking, eerst in de kern, en vervolgens in het cytoplasma voor het genereren van één gestrande volwassen miRNAs4,5. Daarna de volwassen miRNAs zijn opgenomen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC): een multimeric eiwit-RNA complex waarin een lid van de familie van de Argonaute van eiwitten voor de doelgroep erkenning4,5, 6,7. Volwassen miRNAs in de RISC complexe overwegend binden aan de 3-‘ UTR van doel mRNAs8,9,10 , maar ook af en toe kunt binden in de codering en de 5′ UTR regio van de mRNA10,11 . De binding van miRNA naar het mRNA sequenties resultaten in translationeel silencing12,13,14 en in sommige gevallen mRNA destabilisatie15. Aangezien een enkele miRNA veel mRNAs richten kunt, deze regelgevende moleculen zijn betrokken bij bijna alle cellulaire processen en zijn betrokken bij verschillende ziekte voorwaarden16,17,18.
Gedetailleerd begrip van hoe miRNAs cellulaire routes reguleren vereist identificatie van de target mRNAs. Meerdere bioinformatics platforms zijn beschikbaar voor het voorspellen van de vermeende miRNA:mRNA interacties19,20. Deze voorspellingen, is afhankelijk van de perfecte Watson-Crick basis koppeling tussen de 2 – 8 nucleotide zaad opeenvolging van de miRNA en een bijkomende opeenvolging binnen de doelgroep mRNA4,21. Bovendien, deze tools genereren van de secundaire structuur van de miRNA:mRNA duplex, berekenen thermodynamische parameters van deze moleculaire interactie en Toon van instandhouding van de bandplaatsen over soorten te vergroten van functionele relevantie van het doel voorspelling. Helaas hebben deze hulpprogramma’s ook de beperking van het voorspellen van valse positieve doelstellingen op een zeer hoog percentage (~ 27 – 70%)15,22. Bovenal deze platforms in silico niet herkennen van de niet-canonieke interactie van miRNAs met hun doelstellingen23. Deze voorspellende analyses zijn daarom vaak gecombineerd met experimentele methoden voor het valideren van functioneel relevante doelstellingen.
Meerdere benaderingen zijn ontwikkeld voor het proefondervindelijk valideren van miRNA:mRNA interactie. Genetische experimenten met behulp van miRNA nabootsers, bieden sponzen en remmers die veranderen van de niveaus van miRNAs in de cel aanknopingspunten voor het regulerende effect daarvan op de doelgroep gen expressie24,25,26. Bovendien, verslaggever gebaseerd testen via co transfectie van een kloon met de UTR regio 3′ van de target mRNA en miRNA nabootsers of remmers in cellen bewijs te leveren van de regulerende functie van miRNAs26. Terwijl deze methoden cruciaal zijn voor het bestuderen van post-transcriptional regulering van de genexpressie door miRNAs, zijn transfectie efficiëntie en pleotropic gevolgen van wijzigingen in de cellulaire miRNA niveaus belangrijke beperkingen van deze genetische benaderingen23, 26. Daarom zijn complementaire biochemische methoden die peilen naar directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling werkzaam om beter te begrijpen de cellulaire functie van miRNAs.
Een veel gebruikte methode om te studeren van directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling is immunoprecipitation van de RISC complexe gevolgd door de detectie van mRNA doel binnen de complexe27,28,29,30 . Onlangs, een verbeterde RISC val methode werd ook gebruikt om te identificeren van miRNA doelstellingen; het paren stabilisatie van doelen binnen de RISC-miRNA-mRNA tussenproducten met de zuivering van mRNA doelen. Echter, deze methodsface de inherente uitdagingen van niet-specifieke interacties tussen RNA en RNA-bindende eiwitten, die meestal worden gescheiden door cellulaire compartimenten31,32. Bovendien, zijn deze tests afhankelijk van de aanwezigheid van AGO2 eiwitten voor immunoprecipitation van RISC complexe33. Gezien het feit dat AGO2 niet de enige argonaute te bemiddelen efficiënte miRNA:mRNA interacties, kan uitsluiting van andere argonautes leiden tot vooringenomen resultaten34. Daarom, alternatieve strategieën nodig zijn om te studeren van directe binding van miRNA aan mRNA.
In dit verslag, werken we een one-step-aanpak voor directe interactie tussen een miRNA en haar doelstelling indringende mRNA. Eerst, 3′ biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur (LNA) miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen. Vervolgens is het complex in de cellulaire lysate miRNA:mRNA gevangen met behulp van magnetische kralen daar bekleed. Het doel van de mRNA gebonden aan haar complementaire miRNA is gekwantificeerd aan de hand van qPCR.
Identificatie van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs is belangrijk voor het begrijpen van hun regulerende functie. Verschillende computerhulpmiddelen werkzaam zijn te voorspellen van doelstellingen op basis van zaad reeks complementariteit en de instandhouding van doel sequenties19,20. Hoewel deze hulpprogramma’s waardevol zijn, kunnen ze genereren hoge niveaus van zowel valse positieven en valse negatieven. Deze voorspellingen zijn dus gekoppeld aan exper…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies DA037779 (naar J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 en MD007586 (tot C.D.). Het werk werd ook ondersteund door de RCMI Grant G12MD007586, de Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, verlenen de Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA (U54 RR026140 van NCRR/NIH, de U54 Grant MD007593 van NIMHD/NIH en de Tennessee-centrum voor AIDS Onderzoek (P30 AI110527).
Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
DNase | Ambion | AM2238 | |
Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |