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Genetics

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/57786
, , ,
1School of Biotechnology,Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology,Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR ポリメラーゼ連鎖反応による定量化のため。

Abstract

マイクロ Rna (Mirna) は、post-transcriptionally 細胞の遺伝子発現を調節する小さな Rna のクラスです。3′ 非翻訳領域 (UTR) にバインドする Mirna ターゲット蛋白質翻訳を阻害したり、いくつかのインスタンスで mRNA 分解を引き起こす mRNA。3′ UTR マイクロ Rna の 5′ 端に 2-8 塩基種子による mRNA ターゲットの miRNA のバインディング。細胞の制御分子としての Mirna の役割が確立している機能的関連性でターゲット Mrna の同定課題のままです。Bioinformatic ツールは miRNA のバインドの潜在的なターゲットとして 3′ UTR Mrna の内のシーケンスを予測するために採用されています。これらのツールは、機能的な役割を予測する試みの近縁種の中でこのような配列の進化的保存を決定するため利用されています。ただし、これらの計算方法は、しばしば偽陽性の結果を生成、miRNA と mRNA の正規の相互作用を予測する制限されます。したがって、マイクロ Rna、mRNA ターゲットへの直接結合を測定実験の手順、機能的相互作用を確立する必要。本報告では、細胞の miRNA のミール 125b と 3′ UTR PARP 1 mRNA の直接相互作用を検証するため機密性の高いメソッドをについて説明します。合成ビオチン miRNA を模倣された哺乳類細胞にトランスフェクション細胞ライセート ミルナ ・ mRNA 複合体ストレプトアビジン コートした磁気ビーズをおろされたプロトコルを詳しく説明します。最後に、ターゲットは qPCR ベースの戦略を使用してプル ダウン核酸複合体の mRNA の定量化を行った。

Introduction

マイクロ Rna (Mirna) は小さなタンパク質式1を負に制御する rna。マイクロ Rna の前駆体は、ゲノム、遺伝子間領域と蛋白質のコーディングの遺伝子2,3のイントロン内にある最も頻繁の多くの地域でクラスターに存在します。Mirna の miRNA エンコーディングから pri miRNAs の転写を含む遺伝子4。Pri miRNAs はシーケンシャル処理、核最初単一の孤立した成熟 Mirna4,5を生成する細胞質にしを受けます。その後、成熟 Mirna が RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) に組み込まれている: ターゲット認識4,5のための蛋白質のアルゴノート家族のメンバーを含むポリコームタンパク蛋白・ RNA 複合体 6,7。RISC の複合体の成熟 Mirna は主に 3′ UTR ターゲット Mrna8,9,10のバインド、時折、コーディングおよび mRNA の10、11 の 5′ UTR 領域にバインドすることも.MRNA に miRNA のバインディングはシーケンス結果翻訳サイレンシング12,13,14といくつかのケースの mRNA の不安定化の15です。単一のマイクロ Rna は多くの Mrna をターゲットできます、のでこれらの規制の分子細胞のほとんどすべてのプロセスに関与しているし、様々 な病気の条件16,17,18に関与しています。

Mirna が細胞経路を調整する方法の詳細な理解には、ターゲット Mrna の同定が必要です。複数のバイオインフォマティクスのプラットフォームは、推定 miRNA:mRNA 相互作用19,20を予測します。これらの予測は、miRNA の 2-8 塩基種子とターゲット mRNA4,21内補足シーケンスの完璧なワトソン Crick 基本組み合わせに依存します。さらに、これらのツールを miRNA:mRNA 二重の二次構造を生成、この分子間相互作用の熱力学的パラメーターを計算およびターゲットの機能的関連性を高めるために種にわたって結合部位の保全を表示予測。残念ながら、これらのツールも非常に高率 (~ 27-70%)15,22偽肯定的な目標を予測の制限があります。最も重要なは、これらのインシリコプラットフォームは彼らのターゲットの23の miRNAs の非正規の相互作用を認識に失敗します。したがって、そのような予測分析はしばしば機能的関連性の高いターゲットを検証するための実験方法と組み合わせて.

複数のアプローチは、miRNA:mRNA 相互作用の実験的検証に開発されています。MiRNA の模倣を使用して遺伝子実験、スポンジとセルの miRNAs のレベルを変更する阻害剤ターゲット遺伝子発現24,25,26の規制影響について手がかりを提供します。さらに、記者ターゲット mRNA および miRNA mimics の 3′ UTR 領域を含むクローンとの共トランスフェクションによるアッセイまたはセルに阻害剤は、miRNAs26の調節機能の証拠を提供します。これらのメソッドは、Mirna による遺伝子発現の転写後調節を研究することが重要ですが、miRNA の細胞レベルにおける変化のトランスフェクション効率と pleotropic 効果がこれらの遺伝的アプローチ23の主要な制限 26。したがって、miRNA とターゲット間の直接相互作用を調査する補完的な生化学的手法は Mirna の細胞機能を理解するために用いられます。

MiRNA とターゲット間の直接対話を勉強する 1 つの広く使われている方法は、複雑な27,28,29,30 内 mRNA ターゲットの検出によって続いて RISC の複合体の免疫沈降.最近では、RISC トラップ法の改良はまた miRNA ターゲットを識別するために利用されました。それはターゲット mRNA の精製と RISC マイクロ Rna mRNA 中間体内のターゲットの安定化が高まります。ただし、これらの methodsface は、通常、分離細胞コンパートメント31,32の RNA、RNA 結合タンパク質の非特異的相互作用の固有の挑戦。さらに、これらの試金は RISC 複雑な33の免疫沈降の AGO2 タンパク質の存在に依存しています。AGO2 は効率的な miRNA:mRNA の相互作用を仲介するだけのアルゴノートではない、他の argonautes の排除は偏った結果34に 。したがって、mRNA に miRNA の直接結合を勉強する代替戦略が必要です。

本報告で我々 は miRNA とターゲット間の直接対話をプロービングのためのワンステップ アプローチ手の込んだ mRNA。まず、3′ ロックされているビオチン化核酸 (LNA) miRNA 模倣は哺乳類細胞に導入しました。その後、細胞ライセートの複雑な miRNA:mRNA は、ストレプトアビジン コーティング磁気ビーズを用いたがキャプチャされます。その補完の miRNA にバインドされている mRNA ターゲットは、qPCR を使用して定量化されます。

Protocol

1. 3′-ビオチン化マイクロ Rna のトランスフェクション 注: 滅菌層流フードの内部次の手順に従います。 シード 4 x 105–5 × 105 HEK 293 t 細胞あたり 2 mL でよくダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) [DMEM 10% ウシ胎児血清 (FBS) とペン連鎖球菌性抗生物質 x 1] を完了します。37 ° C、5% CO2一晩で設定インキュベーターで培養します。 次の日は、?…

Representative Results

Mirna は、ターゲット Mrna に結合して細胞過程を調節します。したがって、特定の mRNA ターゲット、miRNA の機能を理解する鍵です。ここで我々 は細胞のマイクロ Rna の mRNA ターゲットを識別するための方法を詳しく説明します。このプロトコルは、ワニブックスらから適応35プルダウンにビオチン化 miRNA LNA ベース mimics を利用の変更とは、mRNA ?…

Discussion

携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの同定は彼らの調節の機能を理解するため重要です。シード シーケンス補完とターゲット シーケンス19,20省に基づいてターゲットを予測するいくつかの計算ツールが用いられます。これらのツールは、貴重な彼らは偽陽性と偽陰性の高レベルを生成できます。したがって、これらの予測は、それぞれターゲット<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この仕事は部分的 (装置) に国立衛生研究所 (NIH) の助成金 DA037779 によって支えられた DA024558、DA30896、DA033892、DA021471、AI22960、MD007586 (C.D.) に。仕事も RCMI グラント G12MD007586、ヴァンダービルト CTSA グラント UL1RR024975 によって支えられた Meharry 臨床研究センター (MeTRC) CTSA 付与 (U54 RR026140 傘下/NIH、NIMHD/NIH から U54 グラント MD007593 およびテネシー州エイズ センターから研究 (P30 AI110527)。

Materials

Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D
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References

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Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).
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