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Genetics

बायोटिन आधारित Pulldown परख सेलुलर miRNAs के mRNA लक्ष्यों को मान्य करने के लिए

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/57786
, , ,
1School of Biotechnology,Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology,Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

इस रिपोर्ट में सेल्युलर miRNAs के mRNA लक्ष्यों को मान्य करने के लिए एक तेज़ और विश्वसनीय विधि का वर्णन है । विधि सिंथेटिक biotinylated बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) का उपयोग करता है आधारित miRNA नकल लक्ष्य mRNA पर कब्जा करने के लिए । इसके बाद, streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों को qPCR पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा ठहराव के लिए लक्ष्य mRNA को pulldown करने के लिए कार्यरत हैं ।

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) छोटे गैर कोडिंग RNAs कि पोस्ट-transcriptionally सेलुलर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित के एक वर्ग के हैं । MiRNAs बाइंड करने के लिए 3 ‘ unअनुवादित क्षेत्र (UTR) लक्ष्य mRNA के लिए प्रोटीन अनुवाद को बाधित या कुछ उदाहरणों में mRNA क्षरण के कारण. लक्ष्य mRNA के 3 ‘ UTR करने के लिए miRNA के बंधन miRNA के 5 ‘ अंत में एक 2 – 8 न्यूक्लियोटाइड बीज अनुक्रम द्वारा मध्यस्थता है. जबकि सेलुलर विनियामक अणुओं के रूप में miRNAs की भूमिका अच्छी तरह से स्थापित है, कार्यात्मक प्रासंगिकता के साथ लक्ष्य mRNAs की पहचान एक चुनौती बनी हुई है । Bioinformatic उपकरण miRNA बाध्यकारी के लिए संभावित लक्ष्यों के रूप में mRNAs के 3 ‘ UTR के भीतर अनुक्रम भविष्यवाणी करने के लिए नियोजित किया गया है । इन उपकरणों को भी कार्यात्मक भूमिका की भविष्यवाणी करने का प्रयास में संबंधित प्रजातियों के बीच इस तरह के दृश्यों के विकासवादी संरक्षण का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया गया है । हालांकि, इन गणनात्मक तरीकों अक्सर झूठी सकारात्मक परिणाम उत्पंन और miRNA और mRNA के बीच विहित बातचीत की भविष्यवाणी करने के लिए सीमित हैं । इसलिए, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं है कि अपने mRNA लक्ष्य के लिए miRNA के प्रत्यक्ष बंधन उपाय कार्यात्मक संपर्क स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं । इस रिपोर्ट में, हम सेलुलर miRNA मीर-125b और 3 ‘ UTR के प्प-1 mRNA के बीच सीधी बातचीत को मान्य करने के लिए एक संवेदनशील पद्धति का वर्णन करते हैं । हम एक प्रोटोकॉल जिसमें सिंथेटिक biotinylated-miRNA नकल स्तनधारी कोशिकाओं में transfected थे और miRNA-mRNA परिसर में सेलुलर lysate नीचे streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ खींचा गया था विस्तृत । अंत में, खींच-डाउन न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्स में mRNA लक्ष्य qPCR-आधारित कार्यनीति का उपयोग करके quantified गया.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) छोटे गैर कोडिंग RNAs है कि नकारात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति1को विनियमित रहे हैं । miRNA के अग्रदूतों जीनोम के कई क्षेत्रों के माध्यम से समूहों में रहते हैं, intergenic क्षेत्रों और प्रोटीन के introns-कोडिंग जीन2,3के भीतर सबसे अधिक बार । miRNAs की उत्पत्ति पंचायती राज-miRNA से miRNAs की प्रतिलिपि शामिल-4जीन एंकोडिंग । पंचायती राज-miRNAs क्रमिक प्रसंस्करण से गुजरना, नाभिक में पहले और फिर कोशिका द्रव्य में एकल असहाय परिपक्व miRNAs4,5उत्पंन करने के लिए । इसके बाद, परिपक्व miRNAs को आरएनए-प्रेरित मुंह बंद करने कॉम्प्लेक्स (RISC) में शामिल किया गया है: एक multimeric प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स जिसमें लक्ष्य मान्यता के लिए प्रोटीन के Argonaute परिवार के सदस्य शामिल हैं4,5, 6,7. परिपक्व miRNAs RISC परिसर में मुख्य रूप से 3 ‘ UTR लक्ष्य mRNAs8,9,10 के लिए बाध्य लेकिन यह भी कोडिंग और 5 UTR10,11 के mRNA क्षेत्र में कभी कभार बांध कर सकते है . mRNA के लिए miRNA के बंधन में शोधों के परिणाम मुंह बंद करने12,13,14 और कुछ मामलों में mRNA स्थिरीकरण15. के बाद से एक एकल miRNA कई mRNAs लक्ष्य कर सकते हैं, इन विनियामक अणुओं लगभग हर सेलुलर प्रक्रिया में शामिल है और विभिंन रोग की स्थिति में फंसाया गया है16,17,18।

कैसे miRNAs सेलुलर रास्ते विनियमित की विस्तृत समझ लक्ष्य mRNAs की पहचान की आवश्यकता है । एकाधिक bioinformatics प्लेटफार्मों ख्यात miRNA: mRNA बातचीत19,20भविष्यवाणी करने के लिए उपलब्ध हैं । इन भविष्यवाणियों सही वाट्सन-क्रिकेटरों आधार 2 – 8 न्यूक्लियोटाइड बीज अनुक्रम miRNA और लक्ष्य mRNA4,21के भीतर एक पूरक अनुक्रम के बीच युग्मन पर निर्भर करते हैं । इसके अतिरिक्त, इन उपकरणों miRNA के माध्यमिक संरचना उत्पंन: mRNA द्वैध, इस आणविक बातचीत की ऊष्मा मापदंडों की गणना और प्रजातियों के पार बाध्यकारी साइटों के संरक्षण दिखाने के लिए लक्ष्य की कार्यात्मक प्रासंगिकता बढ़ाने के लिए भविष्यवाणी. दुर्भाग्य से, इन उपकरणों को भी एक बहुत ही उच्च दर (~ 27-70%)15,22पर झूठी सकारात्मक लक्ष्यों की भविष्यवाणी की सीमा है । सबसे महत्वपूर्ण बात, silico प्लेटफार्मों में इन23अपने लक्ष्य के साथ miRNAs की गैर विहित बातचीत को पहचानने में विफल । इसलिए, इस तरह के पूर्वानुमान विश्लेषण अक्सर प्रयोगात्मक तरीकों के साथ संयुक्त कर रहे है कार्यात्मक प्रासंगिक लक्ष्यों को मांय ।

एकाधिक दृष्टिकोण miRNA: mRNA संपर्क को प्रयोग के रूप में मांय करने के लिए विकसित किया गया है । आनुवंशिक miRNA नकल का प्रयोग प्रयोगों, स्पंज और अवरोधकों कि सेल में miRNAs के स्तर को बदलने के लक्ष्य जीन अभिव्यक्ति24,25,26पर अपने विनियामक प्रभाव के लिए सुराग प्रदान करते हैं । इसके अतिरिक्त, एक सह के माध्यम से रिपोर्टर आधारित परख अभिकर्मक लक्ष्य mRNA और miRNA की नकल या कोशिकाओं में अवरोधकों के 3 ‘ UTR क्षेत्र युक्त क्लोन के26miRNAs के विनियामक समारोह के सबूत प्रदान करते हैं । हालांकि इन तरीकों miRNAs द्वारा जीन अभिव्यक्ति के बाद transcriptional विनियमन अध्ययन महत्वपूर्ण हैं, अभिकर्मक दक्षता और pleotropic सेलुलर miRNA स्तर में परिवर्तन के प्रभाव इन आनुवंशिक दृष्टिकोण की प्रमुख सीमाएं हैं23, 26. इसलिए, पूरक जैव रासायनिक तरीकों कि जांच miRNA और उसके लक्ष्य के बीच सीधी बातचीत बेहतर miRNAs के सेलुलर समारोह को समझने के लिए कार्यरत हैं ।

miRNA और इसके लक्ष्य के बीच सीधा संपर्क का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल विधि जटिल27,28,29,30 के भीतर mRNA लक्ष्य का पता लगाने के बाद RISC परिसर के immunoprecipitation है . हाल ही में, एक बेहतर RISC ट्रैप विधि भी miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया था; यह RISC के भीतर लक्ष्यों के जोड़ों स्थिरीकरण-miRNA-mRNA मध्यवर्ती mRNA लक्ष्यों की शुद्धि के साथ । हालांकि, इन methodsface आरएनए और आरएनए-बंधन प्रोटीन है कि आम तौर पर सेलुलर डिब्बों31,३२द्वारा अलग कर रहे है के बीच गैर विशिष्ट बातचीत की अंतर्निहित चुनौतियों का सामना करना पड़ता है । इसके अलावा, इन परख RISC परिसर३३के immunoprecipitation के लिए AGO2 प्रोटीन की उपस्थिति पर निर्भर हैं । यह देखते हुए कि AGO2 केवल argonaute कुशल miRNA मध्यस्थता: mRNA बातचीत नहीं है, अंय argonautes के बहिष्कार पक्षपातपूर्ण परिणाम३४के लिए नेतृत्व कर सकता है । इसलिए, वैकल्पिक रणनीतियों mRNA करने के लिए miRNA के प्रत्यक्ष बंधन का अध्ययन करने की जरूरत है ।

इस रिपोर्ट में, हम एक miRNA और इसके लक्ष्य mRNA के बीच सीधी बातचीत की जांच के लिए एक कदम दृष्टिकोण को विस्तृत करते हैं । सबसे पहले, 3 ‘ biotinylated लॉक न्यूक्लिक एसिड (LNA) miRNA नकल transfected कोशिकाओं में स्तनधारी हैं । फिर, miRNA: सेलुलर lysate में mRNA परिसर streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर कब्जा कर लिया है । इसके पूरक miRNA के लिए बाध्य mRNA लक्ष्य qPCR का उपयोग quantified है.

Protocol

1. अभिकर्मक of 3 ‘-biotinylated miRNA नोट: एक बाँझ लामिना प्रवाह हुड के अंदर निम्न चरणों का पालन करें । बीज 4 x 105-5 x 105 HEK-293T कोशिकाओं को पूरा Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 2 मिलीलीटर में [DMEM 10% भ्रूण गोजातीय ?…

Representative Results

MiRNAs लक्ष्य mRNAs के लिए बाध्यकारी द्वारा सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित । इसलिए, mRNA लक्ष्य की पहचान miRNA फ़ंक्शन को समझने के लिए एक कुंजी है । यहां हम सेलुलर miRNA के mRNA लक्ष्य की पहचान करने के लिए एक वि…

Discussion

सेलुलर miRNAs के mRNA लक्ष्यों की पहचान उनके विनियामक समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । कई गणना उपकरण बीज अनुक्रम complementarity और लक्ष्य के संरक्षण के अनुक्रम19,20के आधार पर लक्ष्य की भविष्?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) अनुदान DA037779 (जेपी के लिए), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 और MD007586 (C.D. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया । इस कार्य को RCMI ग्रांट G12MD007586, द वेंडरबिल्ट CTSA ग्रांट UL1RR024975, द Meharry ट्रांसलेशनल रिसर्च सेंटर (MeTRC) CTSA ग्रांट (U54 RR026140 से NCRR/NIH, U54 अनुदान MD007593 से NIMHD/NIH, और टेनेसी सेंटर फॉर एड्स के सहयोग से भी समर्थन मिला रिसर्च (P30 AI110527) ।

Materials

Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D
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References

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Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).
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