Biotin-basierte Pulldown Assay, Validate mRNA Ziele der zellulären miRNAs
Summary
Dieser Bericht beschreibt eine schnelle und zuverlässige Methode zur Validierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs. Die Methode verwendet, die synthetische biotinylierte gesperrt Nukleinsäure LNA-basierte MiRNA imitiert erfassen gezielt mRNA. Anschließend Streptavidin beschichteten magnetische Beads werden eingesetzt, um Pulldown das Ziel mRNA zur Quantifizierung von qPCR-Polymerase-Kettenreaktion.
Abstract
Micro-RNAs (MiRNAs) sind eine Klasse von kleinen Forensisches RNAs, die post-transcriptionally zellulären Genexpression regulieren. MiRNAs binden an die 3′ untranslatierten Region (UTR) target mRNA zu Protein Übersetzung hemmen oder in einigen Fällen verursachen mRNA Abbau. Die Bindung von MiRNA, die 3′ UTR des Ziels, die mRNA durch eine 2 – 8 Samen Nukleotidsequenz am 5′-Ende der MiRNA vermittelt wird. Während die Rolle von MiRNAs als zelluläre Regulatorische Moleküle gut etabliert ist, bleibt Identifikation von der Ziel-mRNAs mit funktionelle Relevanz eine Herausforderung. Bioinformatic Hilfsmittel sind eingesetzt worden, Sequenzen innerhalb der 3′ UTR von mRNAs als potentielle Ziele für MiRNA Bindung vorherzusagen. Diese Werkzeuge wurden auch genutzt, um die evolutionäre Erhaltung solcher Sequenzen unter verwandten Arten in einem Versuch, die funktionelle Rolle Vorhersagen zu bestimmen. Aber diese Berechnungsmethoden oft falsch-positive Ergebnisse zu generieren und beschränken sich auf die Vorhersage kanonische Zusammenspiel von MiRNA und mRNA. Experimentelle Verfahren, die direkte Bindung von MiRNA mRNA Ziel Messen sind daher notwendig, um funktionelle Interaktion herzustellen. In diesem Bericht beschreiben wir eine empfindliche Methode für die direkte Interaktion zwischen der zellulären MiRNA-MiR-125b und der 3′ UTR von PARP-1 mRNA Validierung. Wir erarbeiten ein Protokoll, in dem synthetischen biotinylierte-MiRNA imitiert wurden in Säugerzellen transfiziert und der MiRNA-mRNA-Komplex in die zelluläre lysate wurde mit magnetischen Beads Streptavidin beschichteten abgerissen. Schließlich das Ziel, die, das mRNA in das nach unten gezogen-Nukleinsäure komplexe quantifiziert wurde mit einem qPCR-basierte Strategie.
Introduction
Micro-RNAs (MiRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die Protein-Expression-1negativ regulieren. Vorläufer der MiRNA befinden sich im Cluster durch viele Regionen des Genoms, am häufigsten in den intergenetischer Regionen und Introns der Protein-kodierenden Gene2,3. Biogenese von MiRNAs beinhalten Transkription von Pri-MiRNAs von MiRNA-Kodierung Gene4. Die Pri-MiRNAs unterziehen sequenzielle Verarbeitung, zuerst in den Zellkern und dann im Zytoplasma, einzelne gestrandeten Reife MiRNAs4,5zu generieren. Anschließend die Reife MiRNAs fließen in den RNA-induced silencing-Komplex (RISC): ein Multimeric Protein-RNA-Komplex, der ein Mitglied der Argonaut-Familie von Proteinen für Ziel Anerkennung4,5, enthält 6,7. Reife MiRNAs in komplexen RISC überwiegend binden an die 3′ UTR Ziel mRNAs8,9,10 aber können auch gelegentlich in der Kodierung und der 5′ UTR Region der mRNA10,11 binden . Die Bindung von MiRNA, die mRNA-Sequenzen Ergebnisse in translational stummschaltungs-12,13,14 und in einigen Fällen mRNA Destabilisierung15. Da ein einzelnes MiRNA viele mRNAs ausrichten kann, diese Regulatorische Moleküle sind fast alle zellulären Prozess beteiligt und haben in verschiedenen Krankheit Bedingungen16,17,18in Verbindung gebracht.
Detailliertes Verständnis der wie MiRNAs zelluläre Signalwege regulieren erfordert Identifizierung des Ziels mRNAs. Mehrere Bioinformatik-Plattformen zur Verfügung, vermeintliche MiRNA:mRNA Interaktionen19,20vorherzusagen. Diese Vorhersagen verlassen sich auf perfekte Watson-Crick-Basenpaarung zwischen den 2 – 8 Samen Nukleotidsequenz von der MiRNA und einer komplementären Sequenz innerhalb der Ziel-mRNA-4,–21. Darüber hinaus diese Tools generieren Sekundärstruktur des MiRNA:mRNA Duplex, thermodynamischen Parameter dieser molekularen Wechselwirkung berechnen und zeigen Erhaltung der die Bindungsstellen über Artgrenzen, funktionelle Relevanz des Ziels zu verbessern Vorhersage. Leider haben diese Tools auch die Begrenzung der Vorhersage falsch positive Ziele um eine sehr hohe Rate (~ 27 – 70 %)15,22. Am wichtigsten ist, nicht diese in Silico -Plattformen, der nicht-kanonischen Wechselwirkungen von MiRNAs mit ihrer Ziele23zu erkennen. Daher sind solche vorausschauenden Analysen oft mit experimentellen Methoden, um funktionell relevante Ziele validieren kombiniert.
Mehrere Ansätze wurden entwickelt, um MiRNA:mRNA Wechselwirkung experimentell zu überprüfen. Genetische Experimente mit MiRNA Mimik, Aufschlüsse Schwämme und Inhibitoren, die die Ebenen von MiRNAs in der Zelle ändern für seine regulierende Wirkung auf die Ziel-Gen Ausdruck24,25,26. Darüber hinaus Reporter basierte Assays über Co-Transfektion eines Klons mit der 3′ UTR-Region von der Ziel-mRNA und MiRNA-Fließbildern oder Inhibitoren in Zellen liefern Hinweise auf die regulatorische Funktion der MiRNAs26. Während diese Methoden entscheidend für posttranskriptionelle Regulation der Genexpression von MiRNAs studieren, sind Transfektion Effizienz und Pleotropic Effekte von Veränderungen in der zellulären MiRNA Ebenen wesentliche Einschränkungen diese gentechnische Ansätze23, 26. Daher werden ergänzende biochemische Methoden, die direkte Interaktion zwischen MiRNA und seinem Ziel Sonde eingesetzt, um besser zu verstehen, die zelluläre Funktion der MiRNAs.
Eine weit verbreitete Methode, direkte Interaktion zwischen MiRNA und seinem Ziel zu studieren ist Immunopräzipitation der RISC Komplex, gefolgt von den Nachweis von mRNA Ziel innerhalb der komplexen27,28,29,30 . Vor kurzem wurde auch eine verbesserte RISC-Trap-Methode eingesetzt, um MiRNA Ziele zu identifizieren; Stabilisierung der Ziele innerhalb der RISC-MiRNA-mRNA Zwischenprodukte Paare es mit der Reinigung der mRNA-Ziele. Aber diese Methodsface die inhärenten Herausforderungen der unspezifische Wechselwirkungen zwischen RNA und RNA-bindende Proteine, die in der Regel von zellulären Kompartimenten31,32getrennt werden. Darüber hinaus sind diese Tests auf das Vorhandensein von Protein AGO2 für Immunopräzipitation RISC Komplex33angewiesen. Angesichts der Tatsache, dass AGO2 nicht die einzige Argonaut ist, effiziente MiRNA:mRNA Interaktionen vermitteln, führen verzerrte Ergebnisse34Ausschluss von anderen Argonautes. Deshalb sind alternative Strategien erforderlich, um direkte Bindung von MiRNA zu mRNA zu studieren.
In diesem Bericht erarbeiten wir einen einstufigen Ansatz zum Sondieren direkte Interaktion zwischen einem MiRNA und seinem Ziel mRNA. Erstens sind 3′ biotinylierte gesperrt Nukleinsäure (LNA) MiRNA Mimik in Säugerzellen transfiziert. Dann ist der MiRNA:mRNA Komplex in die zelluläre lysate mit Streptavidin beschichteten magnetische Beads erfasst. Die mRNA-Ziel verpflichtet, seine ergänzenden MiRNA wird quantifiziert mit qPCR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identifizierung von mRNA Ziele der zellulären MiRNAs ist wichtig für das Verständnis ihrer regulatorischen Funktion. Mehreren Berechnungswerkzeuge werden eingesetzt, um Ziele auf der Grundlage Samen Reihenfolge Komplementarität und die Erhaltung der Ziel-Sequenzen19,20vorherzusagen. Obwohl diese Tools wertvoll sind, können sie hohe falsch positive und falsch negative generieren. Daher sind diese Vorhersagen gekoppelt mit experimentellen Methoden wie Immunopr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch die National Institutes of Health (NIH) Zuschüsse DA037779 (zu J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 und MD007586 (auf CD). Auch die RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, unterstützen die Arbeit war das Meharry translationale Research Center (MeTRC) CTSA gewähren (U54 RR026140 von NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 aus NIMHD/NIH und der Tennessee-Center for AIDS Forschung (P30 AI110527).
Materials
| Cell line- HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) | GIBCO/Thermofisher | 10438-026 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | GIBCO/Thermofisher | 11995-065 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (1x) | GIBCO/Thermofisher | 20012-027 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | GIBCO/Thermofisher | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (100x) | Cellgro/Mediatech | 30-002-CI | |
| DNase | Ambion | AM2238 | |
| Opti-MEM Reduced serum media | GIBCO/Thermofisher | 3198-088 | |
| Liopfectamine 2000 Transfection reagent | Invitrogen/ Thermofisher | 11668-019 | |
| Biotinylated hsa-miR-125b | Exiqon | 339178/ID-27281622 | |
| Biotinylated scrambled control | Exiqon | 479997-671/ID-714884 | |
| IGEPAL | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| Streptavidin Magnetic beads | Pierce | 88816 | |
| Yeast tRNA | Invitrogen/Thermofisher | 15401-011 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Potassium chloride (KCl) solution | Sigma-Aldrich | 60142 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) solution | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| Superase | Ambion/Thermofisher | AM2694 | |
| Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RNAse/DNAse free water | GIBCO/Thermofisher | 10977-015 | |
| RNeasy extraction kit | Qiagen | 74104 | |
| iScript-Select cDNA synthesis kit | Biorad | 170-8897 | |
| qPCR Primers | Invitrogen/Thermofisher | ||
| iTaq-Universal SYBR green supermix | Biorad | 172-5120 | |
| DynaMag-Spin Magnet | Invitrogen/Thermofisher | 12320D |
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