JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/57786
, , ,
1School of Biotechnology,Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology,Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

Summary

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) vormen een klasse van kleine noncoding RNAs die post-transcriptionally cellulaire genexpressie regelen. MiRNAs binden aan de 3′ niet-vertaalde regio (UTR) van target mRNA te remmen eiwit vertaling of in sommige gevallen leiden tot aantasting van het mRNA. De binding van de miRNA aan de 3-‘ UTR van het streefcijfer dat mRNA wordt gemedieerd door een 2 – 8 nucleotide zaad reeks eind 5’ miRNA. Terwijl de rol van miRNAs als cellulaire regelgevende moleculen goed ingeburgerd is, blijft identificatie van de target mRNAs met functionele relevantie een uitdaging. Bioinformatic hulpmiddelen zijn tewerkgesteld te voorspellen van reeksen binnen de 3-‘ UTR van mRNAs als doelwit voor miRNA bindend. Deze hulpprogramma’s zijn ook gebruikt om te bepalen van de evolutionaire instandhouding van dergelijke sequenties onder Verwante soorten in een poging om te voorspellen van functionele rol. Echter deze rekenmethoden vaak vals-positieve resultaten genereren en zijn beperkt tot het voorspellen van de canonieke interactie tussen miRNA en mRNA. Experimentele procedures die meten van directe binding van miRNA aan haar doelstelling van mRNA zijn daarom noodzakelijk vast te stellen functionele interactie. In dit verslag beschrijven we een gevoelige methode voor de validatie van de directe interactie tussen de cellulaire miRNA miR-125 ter en de 3’ UTR van PARP-1 mRNA. Wij werken een protocol waarin synthetische biotinyleerd-miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen en de miRNA-mRNA-complex in de cellulaire lysate werd gesloopt met streptavidine beklede magnetische kralen. Tot slot, het doel dat mRNA in de trok-down nucleic acid complex werd gekwantificeerd aan de hand van een qPCR gebaseerde strategie.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) zijn klein niet-coderende RNAs die eiwit expressie1negatief te regelen. Precursoren van miRNA bevinden zich in clusters door vele regio’s van het genoom, vaakst binnen de intergenic regio’s en de introns van eiwit-codeert genen2,3. Biogenese van miRNAs betrekken transcriptie van de pri-miRNAs van miRNA-encoding genen4. De pri-miRNAs ondergaan sequentiële verwerking, eerst in de kern, en vervolgens in het cytoplasma voor het genereren van één gestrande volwassen miRNAs4,5. Daarna de volwassen miRNAs zijn opgenomen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC): een multimeric eiwit-RNA complex waarin een lid van de familie van de Argonaute van eiwitten voor de doelgroep erkenning4,5, 6,7. Volwassen miRNAs in de RISC complexe overwegend binden aan de 3-‘ UTR van doel mRNAs8,9,10 , maar ook af en toe kunt binden in de codering en de 5′ UTR regio van de mRNA10,11 . De binding van miRNA naar het mRNA sequenties resultaten in translationeel silencing12,13,14 en in sommige gevallen mRNA destabilisatie15. Aangezien een enkele miRNA veel mRNAs richten kunt, deze regelgevende moleculen zijn betrokken bij bijna alle cellulaire processen en zijn betrokken bij verschillende ziekte voorwaarden16,17,18.

Gedetailleerd begrip van hoe miRNAs cellulaire routes reguleren vereist identificatie van de target mRNAs. Meerdere bioinformatics platforms zijn beschikbaar voor het voorspellen van de vermeende miRNA:mRNA interacties19,20. Deze voorspellingen, is afhankelijk van de perfecte Watson-Crick basis koppeling tussen de 2 – 8 nucleotide zaad opeenvolging van de miRNA en een bijkomende opeenvolging binnen de doelgroep mRNA4,21. Bovendien, deze tools genereren van de secundaire structuur van de miRNA:mRNA duplex, berekenen thermodynamische parameters van deze moleculaire interactie en Toon van instandhouding van de bandplaatsen over soorten te vergroten van functionele relevantie van het doel voorspelling. Helaas hebben deze hulpprogramma’s ook de beperking van het voorspellen van valse positieve doelstellingen op een zeer hoog percentage (~ 27 – 70%)15,22. Bovenal deze platforms in silico niet herkennen van de niet-canonieke interactie van miRNAs met hun doelstellingen23. Deze voorspellende analyses zijn daarom vaak gecombineerd met experimentele methoden voor het valideren van functioneel relevante doelstellingen.

Meerdere benaderingen zijn ontwikkeld voor het proefondervindelijk valideren van miRNA:mRNA interactie. Genetische experimenten met behulp van miRNA nabootsers, bieden sponzen en remmers die veranderen van de niveaus van miRNAs in de cel aanknopingspunten voor het regulerende effect daarvan op de doelgroep gen expressie24,25,26. Bovendien, verslaggever gebaseerd testen via co transfectie van een kloon met de UTR regio 3′ van de target mRNA en miRNA nabootsers of remmers in cellen bewijs te leveren van de regulerende functie van miRNAs26. Terwijl deze methoden cruciaal zijn voor het bestuderen van post-transcriptional regulering van de genexpressie door miRNAs, zijn transfectie efficiëntie en pleotropic gevolgen van wijzigingen in de cellulaire miRNA niveaus belangrijke beperkingen van deze genetische benaderingen23, 26. Daarom zijn complementaire biochemische methoden die peilen naar directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling werkzaam om beter te begrijpen de cellulaire functie van miRNAs.

Een veel gebruikte methode om te studeren van directe interactie tussen miRNA en haar doelstelling is immunoprecipitation van de RISC complexe gevolgd door de detectie van mRNA doel binnen de complexe27,28,29,30 . Onlangs, een verbeterde RISC val methode werd ook gebruikt om te identificeren van miRNA doelstellingen; het paren stabilisatie van doelen binnen de RISC-miRNA-mRNA tussenproducten met de zuivering van mRNA doelen. Echter, deze methodsface de inherente uitdagingen van niet-specifieke interacties tussen RNA en RNA-bindende eiwitten, die meestal worden gescheiden door cellulaire compartimenten31,32. Bovendien, zijn deze tests afhankelijk van de aanwezigheid van AGO2 eiwitten voor immunoprecipitation van RISC complexe33. Gezien het feit dat AGO2 niet de enige argonaute te bemiddelen efficiënte miRNA:mRNA interacties, kan uitsluiting van andere argonautes leiden tot vooringenomen resultaten34. Daarom, alternatieve strategieën nodig zijn om te studeren van directe binding van miRNA aan mRNA.

In dit verslag, werken we een one-step-aanpak voor directe interactie tussen een miRNA en haar doelstelling indringende mRNA. Eerst, 3′ biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur (LNA) miRNA nabootsers zijn transfected in zoogdiercellen. Vervolgens is het complex in de cellulaire lysate miRNA:mRNA gevangen met behulp van magnetische kralen daar bekleed. Het doel van de mRNA gebonden aan haar complementaire miRNA is gekwantificeerd aan de hand van qPCR.

Protocol

1. de transfectie van 3′-biotinyleerd miRNA Opmerking: Voer de volgende stappen binnen een steriele laminar flow hood. Zaad 4 x 105–5 x 105 HEK-293T cellen per putje in 2 mL zuiver voltooien Dulbecco van bewerkt Eagle Medium (DMEM) [DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1 x Pen-strep antibioticum]. Cultuur van de cellen in een incubator ingesteld bij 37 ° C, 5% CO2 ‘s nachts. De volgende dag, Controleer de gezondheid en de h…

Representative Results

MiRNAs regelen cellulaire processen door binding aan target mRNAs. Identificeren mRNA doelstellingen zijn dus een sleutel tot het begrijpen van miRNA functie. Hier werken we een methode voor het identificeren van mRNA doelwit van cellulaire miRNA. Dit protocol is aangepast van Wani et al. 35 met de wijziging van het gebruik van biotinyleerd LNA gebaseerde miRNA nabootsers aan pulldown target mRNA. Het gebruik van oligonucleotide LNA gebaseerde nabootsers v…

Discussion

Identificatie van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs is belangrijk voor het begrijpen van hun regulerende functie. Verschillende computerhulpmiddelen werkzaam zijn te voorspellen van doelstellingen op basis van zaad reeks complementariteit en de instandhouding van doel sequenties19,20. Hoewel deze hulpprogramma’s waardevol zijn, kunnen ze genereren hoge niveaus van zowel valse positieven en valse negatieven. Deze voorspellingen zijn dus gekoppeld aan exper…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies DA037779 (naar J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 en MD007586 (tot C.D.). Het werk werd ook ondersteund door de RCMI Grant G12MD007586, de Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, verlenen de Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA (U54 RR026140 van NCRR/NIH, de U54 Grant MD007593 van NIMHD/NIH en de Tennessee-centrum voor AIDS Onderzoek (P30 AI110527).

Materials

Cell line- HEK293T cells ATCC CRL-3216
Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS) GIBCO/Thermofisher 10438-026
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) GIBCO/Thermofisher 11995-065
Phosphate buffered saline (PBS) (1x) GIBCO/Thermofisher 20012-027
Trypsin-EDTA (0.25%)  GIBCO/Thermofisher 25200-056
Penicillin-Streptomycin solution (100x) Cellgro/Mediatech 30-002-CI
DNase  Ambion AM2238
Opti-MEM Reduced serum media GIBCO/Thermofisher 3198-088
Liopfectamine 2000 Transfection reagent Invitrogen/ Thermofisher 11668-019
Biotinylated hsa-miR-125b Exiqon 339178/ID-27281622
Biotinylated scrambled control Exiqon 479997-671/ID-714884
IGEPAL Sigma-Aldrich 18896
Streptavidin Magnetic beads Pierce 88816
Yeast tRNA Invitrogen/Thermofisher 15401-011
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
Potassium chloride (KCl) solution Sigma-Aldrich 60142
Magnesium chloride (MgCl2) solution Sigma-Aldrich M1028
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 795429
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0 Sigma-Aldrich E7889
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
Superase Ambion/Thermofisher AM2694
Protease Inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RNAse/DNAse free water GIBCO/Thermofisher 10977-015
RNeasy extraction kit Qiagen 74104
iScript-Select cDNA synthesis kit Biorad 170-8897
qPCR Primers  Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR green supermix Biorad 172-5120
DynaMag-Spin Magnet Invitrogen/Thermofisher 12320D
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
  3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  5. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
  6. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
  7. Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
  8. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
  10. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
  11. Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5′-UTR and 3′-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
  12. Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
  13. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
  14. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
  15. Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
  16. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  17. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  18. Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
  19. Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
  20. Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
  21. Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
  22. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
  23. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
  24. Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
  25. Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
  26. Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340 (2015).
  27. Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
  28. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
  29. Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
  30. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
  31. Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
  32. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  33. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
  34. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
  35. Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
  36. Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents?. BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
  37. Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
  38. Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
  39. Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
  40. Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
  41. Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
  42. Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer’s disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
  43. Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
  44. Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
  45. Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3′-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
  46. Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
  47. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).

Tags

Biotinylated MiRNA MimicsMRNA TargetsPulldown AssayLocked Nucleic AcidsStreptavidin-coated Magnetic BeadsMiRNA-mRNA InteractionsMiRNA BiologyMiRNA Therapeutics
check_url/57786?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs. J. Vis. Exp. (136), e57786, doi:10.3791/57786 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image