Summary

استخدام "واحد جزيء فلوري في الموقع التهجين" (SM-الأسماك) إلى مرناس Quantify و Localize في "بويضات مورين"

Published: April 24, 2019
doi:

Summary

لعد تكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، صف واحد جزيء الحمض النووي الريبي في الموقع الأمثل التهجين (الحمض النووي الريبي-الأسماك) للخلايا غير ملتصقة. بويضات جمعت وتهجين مع تحقيقات محددة نسخة، وكمياً باستخدام برنامج تقدير حجم صورة.

Abstract

وتشمل الأساليب الحالية المستخدمة بشكل روتيني لتقدير مرناً في بويضات والأجنة الرقمي النسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (دبكر) والكمية، في الوقت الحقيقي RT-PCR (RT-qPCR) وتسلسل الحمض النووي الريبي. عندما يتم تنفيذ هذه التقنيات باستخدام واحدة من البويضات أو الأجنة، لا يتم كشف مرناس منخفضة-نسخة موثوق بها. للتغلب على هذه المشكلة، بويضات أو أجنة يمكن أن تجمع معا للتحليل؛ ومع ذلك، وهذا غالباً ما يؤدي إلى تباين عال بين العينات. في هذا البروتوكول، يصف لنا استخدام الفلورية في الموقع التهجين (الأسماك) استخدام تشعبت كيمياء الحمض النووي. ويحدد هذا الأسلوب النمط المكاني مرناس في الخلايا الفردية. عندما يقترن التقنية “العثور على الفور” وتتبع برامج الكمبيوتر، يمكن أيضا قياس وفرة مرناس في الخلية. باستخدام هذا الأسلوب، وهناك انخفاض تقلب داخل مجموعة تجريبية وعدد أقل من بويضات والأجنة هي المطلوبة للكشف عن اختلافات كبيرة بين المجموعات التجريبية. متوفرة تجارياً الحمض النووي تشعبت SM-مجموعات الأسماك قد تم الأمثل للكشف عن مرناس في مقطعة الأنسجة أو الخلايا ملتصقة على الشرائح. ومع ذلك، بويضات لا تلتزم بشكل فعال الشرائح وبعض الكواشف في المجموعة التي كانت قاسية جداً أدى إلى تفسخ البويضيه. لمنع هذا تحلل، تم إجراء تعديلات عدة لطقم السمك. على وجه التحديد، استبدال البويضيه مخازن بيرميبيليزيشن، والمياه والصرف الصحي المصممة الفلورة بويضات والأجنة في مخازن الملكية. أجريت بيرميبيليزيشن ويغسل، وإينكوبيشنز مع تحقيقات ومكبر للصوت في لوحات 6-جيدا ووضعت بويضات على الشرائح في نهاية البروتوكول باستخدام وسائل الإعلام المتزايدة. وكانت هذه التعديلات قادرة على التغلب على القيود المفروضة على عدة متاحة تجارياً، على وجه الخصوص، تحلل البويضيه. بدقة، وتكاثر عدد مرناس في بويضات الفردية، تم استخدام برامج الكمبيوتر. معا، وهذا البروتوكول يمثل بديلاً لبكر وتسلسل مقارنة التعبير عن وقائع محددة في الخلايا المفردة.

Introduction

وقد عكس المنتسخة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) معيار الذهب كوانتيتاتيون مرناً. وتستخدم حاليا فحوصات اثنين والرقمية بكر (دبكر)1 والوقت الحقيقي، والكمية بكر (qPCR)2 . تقنيات PCR اثنين، قد دبكر حساسية أكبر من قبكر مما يوحي بأنه يمكن استخدامه لقياس وفرة مرناً في الخلايا المفردة. ومع ذلك، أنتج تحليل دبكر مرناس وفرة منخفضة في برك من 5 إلى 10 بويضات كل كل عينة تجريبية في أيدينا، البيانات مع إمكانية تكرار نتائج منخفضة وعالية التباين3. ومن المرجح نتيجة لخطأ التجريبية المرتبطة باستخراج الحمض النووي الريبي وكفاءة النسخ العكسي. تسلسل الحمض النووي الريبي قد أجريت باستخدام ماوس واحدة وبويضات بشرية4،5. ويتطلب هذا الأسلوب كدنا التضخيم الخطوات المطلوبة لتوليد المكتبة مما يزيد من احتمال تقلب داخل مجموعة تجريبية. وعلاوة على ذلك، قد لا تكون النصوص وفرة منخفضة قابلة للاكتشاف. على الرغم من أن تسلسل الأسعار تراجعت في السنوات القليلة الماضية، لا يزال يمكن أن يكون تكلفة باهظة بسبب التكلفة العالية للتحليلات المعلوماتية. وأخيراً، مرناً الترجمة عملية دينامية مع التغيرات المكانية المساهمة في وظيفة البروتين6. ولذلك، نحن المبينة على اعتماد أسلوب التي ستنتج التدابير الكمية الدقيقة واستنساخه وتوطين مرناس الفردية في بويضات واحد.

تشعبت الحمض النووي بالإضافة إلى الأسفار في التهجين الموقعي تضخيم الإشارات fluorescence بدلاً من زيادة الحمض النووي الريبي/كدنا تمكين الكشف عن مرناس واحدة في الخلايا الفردية 7،،من89. الفحص يتم من خلال سلسلة من التهجين والتضخيم (باستخدام الحمض النووي تشعبت) والأسفار وسم خطوات من أجل تضخيم الإشارات fluorescence7. ويبدأ التقنية ملزمة أزواج مسبار اليغنوكليوتيد 18-25 قاعدة مكملة لمحددة مرناً3،،من810. أزواج التحقيق خمسة عشر إلى عشرين مصممة لخصوصية ضمان كل نسخة لنص الهدف. ويعقب التهجين مرناً على حدة تحقيقات ما قبل مكبر للصوت ومكبر للصوت التي تشكل تكويناً متفرع. تقريبا، ربط 400 التسمية fluorophores كل مكبر للصوت، أدى إلى زيادة 8000-fold في الأسفار يتيح الكشف عن مرناس الفردية (الشكل 1)11.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي البروتوكول SM-الأسماك- التهجين متسلسلة من محاضر جلسات التحقيق المحددة، تشعبت الحمض النووي مكبر للصوت وفلوروفوري إلى هدف يرد مرناً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

خلية الدراسات السابقة باستخدام جزيء واحد الأسفار في الموقع مرناس β-أكتين التهجين (SM-الأسماك) المترجمة في الخلايا العصبية الفردية12 وفيروس الورم الحليمي البشري الحمض النووي في سرطان عنق الرحم خطوط7. برامج الكمبيوتر “العثور على الفور” و “تتبع البرنامج” يحدد إشارة الفلورسنت الشروريه الفردية وقد استخدمت بنجاح لتقدير عدد مرناس في كل خلية3،13.

استناداً إلى نتائج الكشف مرناً في الخلايا العصبية12، افترضنا أن SM-الأسماك من شأنه أن يثبت أداة مفيدة كوانتيتاتي مستويات نسخة في بويضات مورين والأجنة بما في ذلك مرناس وفرة منخفضة. ومع ذلك، الأسلوب هو الأمثل للاستخدام مع خلايا ثابتة ملتصقة وفورمالدهايد ثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ أقسام الأنسجة (فب). لا يمكن أن تلتزم بويضات شريحة، حتى عندما كانوا المغلفة مع بولي-L-يسين. وعلاوة على ذلك، فأكثر هشاشة من خلايا جسدية وأقسام الأنسجة الناتجة في تحلل الخلية عند التعرض لبعض المخازن المؤقتة الملكية في مجموعات المتاحة تجارياً3. للتغلب على هذه التحديات، بويضات كانت ثابتة ونقلها يدوياً بين قطرات من المخازن المؤقتة. وعلاوة على ذلك، استعيض عن مخازن بيرميبيليزيشن، والمياه والصرف الصحي في المجموعات لتقليل تحلل الخلية. المسابر المصممة مسبقاً يتم شراؤها جنبا إلى جنب مع مجموعة الأسماك أو يمكن أن يطلب إلى وقائع محددة. يتوفر كل مجموعة التحقيق الملكية في واحدة من ثلاث قنوات الفلورية (C1 و C2 و C3) للسماح بالإرسال المتعدد. في التجربة الحالية، كانت بويضات موريني المزدوج الملون وكمياً باستخدام مجس C2 نانوج وتحقيق C3 Pou5f1 . واختيرت هذه المسابر استناداً إلى التعبير عنها نانج و Pou5f1 في بويضات والأجنة. في ختام خطوات التهجين، وضعت بويضات في قطرات من تصاعد تتلاشى المضادة وسائل الإعلام لتطبيقها على الشرائح النسيجي. واستخدمت الصور [كنفوكل] للتحديد الكمي لعدد الإشارات الفلورسنت الشروريه التي تمثل مرناس الفردية. بالإضافة إلى تحديد كمية مرناس، كما أظهر تصوير التوزيع المكاني مرناً محددة في الخلية، يتم فيها أساليب القياس الكمي الحمض النووي الريبي أخرى غير قادر على تحقيق. وتبين هذه التقنية قد تقلب منخفض داخل مجموعة تجريبية تسمح باستخدام عدد أقل من بويضات في كل مجموعة تجريبية لتحديد وجود اختلافات كبيرة بين المجموعات التجريبية3.

Protocol

إجراءات الحيوان تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة في جامعة نبراسكا-لينكولن وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والأنظمة. لهذه الدراسة، أووتبريد مؤتمر نزع السلاح-1 الفئران كانت متواصلة للوصول إلى تشو القوارض العادية والمياه؛ أنها اس?…

Representative Results

عند انتهاء البروتوكول، وسوف تكون النتيجة صور منفردة من سلسلة z [كنفوكل] (4A الشكل و الشكل 5)، مخيط الصور (الشكل 4)، وتحسب مرناً (الشكل 4)- عندما يتم إجراء الإرسال المتعدد، سيكون هناك أ?…

Discussion

سوف تضمن سلسلة من الخطوات البسيطة خلال البروتوكول fluorescence ناجحة ودقيقة تهم مرناس. أولاً، يجب إجراء البروتوكول فورا بعد جمع والتثبيت لبويضات. لاحظ أن تتم إضافة حماية الأصناف النباتية إلى المخزن المؤقت التثبيت بارافورمالدهيد 4% لمنع بويضات من الالتصاق ببعضها البعض. وجدنا أنه من الضروري إجرا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور دانييل ر. لارسون لمساعدته السخية مع تركيب واستخدام ل العثور على الفور وتتبع البرنامج 13 والدعم التقني لجامعة نبراسكا لنكولن مجهرية الأساسية للتصوير المجهري [كنفوكل]. هذه الدراسة يمثل مساهمة من جامعة “نبراسكا شعبة البحوث الزراعية”، لينكولن في نبراسكا، وتدعمها “أموال هاتش نتحدث عنه” (NEB-26-206/الانضمام رقم-232435 ورقم NEB-26-231/الانضمام-1013511).

Materials

(±)-α-Lipoic acid Sigma-Aldrich T1395 Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid MP Biomedicals, LLC 199899 FAF BSA
BD 10mL TB Syringe Becton, Dickinson and Company 309659 10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Company 305109 27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 CaCl2-2H2O
Citric acid Sigma-Aldrich C2404 Citrate
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 Glucose
Disodium phosphate Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish Falcon Corning 351008 35 mm dish
Edetate Disodium Avantor 8994-01 EDTA
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum Atlanta biologicals S10250 FBS
Gentamicin Reagent Solution gibco 15710-064 Gentamicin
GlutaMAX-I (100X) gibco 35050-061 Glutamax
Gold Seal Micro Slides Gold Seal 3039 25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum Sigma G4877 eCG
hCG recombinant NHPP AFP8456A hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes Sigma-Aldrich H3884 Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps Integra 17-305X Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid  MP Biomedicals, LLC 190228 L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M2773 MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids Corning  25-025-Cl NEAA
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-C 25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501891-C2 Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501611-C3 Pou5f1 Probe
MOPS Sigma-Aldrich M3183
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile Millex-GP SLGP033RS 0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P0930 PVP
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60128 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60218 KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent invitrogen P36934 Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI Advanced Cell Diagnostics 320858 DAPI
RNAscope FL AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 320852 Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 320853 Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 320854 Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A Advanced Cell Diagnostics 320855 Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B Advanced Cell Diagnostics 320856 Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C Advanced Cell Diagnostics 320857 Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit Advanced Cell Diagnostics 320851 FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics 320871 Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control Advanced Cell Diagnostics 320881 Positive Control
RNAscope Probe Diluent Advanced Cell Diagnostics 300041 Probe Diluent
RNAscope Protease III Advanced Cell Diagnositics 322337 Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 322340 FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV Advanced Cell Diagnostics 322336 Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G Component Supply Co. NE-301PL-50 blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma-Aldrich S6191 NaCl
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 306576 NaOH
Sodium pyruvate, >= 99% Sigma-Aldrich P5280 Pyruvate
Solution 6 Well Dish Agtechinc D18 6 well dish
Taurine Sigma-Aldrich T8691 Taurine
Tissue Culture Dish Falcon Corning 353002 60 mm dish
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Triton X-100

References

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
  3. Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).
  4. Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
  5. Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. . Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
  6. Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
  7. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
  8. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  9. Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
  10. Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  11. Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).
  12. Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
  13. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  14. Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
  15. Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
  16. Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
  17. Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
  18. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
  19. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
  20. Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
  21. Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4 (2016).
  22. Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
  23. Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).
  24. Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
  25. Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, (2016).
  26. Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
  27. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).
  28. Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15 (2003).

Play Video

Cite This Article
Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).

View Video