Summary

Utilisation d’unique molécule fluorescente hybridation In Situ (FISH-SM) afin de quantifier et Localize ARNm dans les ovocytes murin

Published: April 24, 2019
doi:

Summary

Pour compter reproductible les numéros des ARNm dans les ovocytes, in situ en fluorescence seule molécule RNA hybridation (RNA-poisson) a été optimisée pour les cellules non adhérentes. Ovocytes ont été recueillis, hybridaient avec des sondes spécifiques de transcription et quantifiées à l’aide d’un logiciel de quantification d’image.

Abstract

Cours méthodes couramment utilisées pour quantifier les ARNm d’ovocytes et d’embryons incluent réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse numérique (dPCR), RT-PCR quantitative, en temps réel (RT-qPCR) et le séquençage de RNA. Lorsque ces techniques sont effectuées à l’aide d’un seul ovocyte ou embryon, ARNm de faibles copies n’est pas détectées avec fiabilité. Pour surmonter ce problème, des ovocytes ou des embryons peuvent être regroupés ensemble pour l’analyse ; Toutefois, cela conduit souvent à la grande variabilité entre les échantillons. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation de l’hybridation in situ fluorescence (FISH) à l’aide de chimie de l’ADN ramifié. Cette technique identifie la répartition spatiale des ARNm dans les cellules individuelles. Lorsque la technique est associée à la recherche de Spot et logiciels de suivi, l’abondance des ARNm dans les cellules peut également être quantifiée. En utilisant cette technique, il existe une variabilité réduite au sein d’un groupe expérimental et moins des ovocytes et des embryons sont nécessaires pour détecter des différences significatives entre les groupes expérimentaux. Disponible dans le commerce ramifiée ADN-SM-kits de poissons ont été optimisés pour détecter les ARNm de coupes de tissus ou cellules adhérentes sur des lames. Cependant, les ovocytes n’adhèrent pas efficacement aux diapositives et certains réactifs de la trousse ont été trop sévères, aboutissant à la lyse de l’ovocyte. Pour éviter cette lyse, plusieurs modifications ont été apportées au kit de poissons. Plus précisément, tampons conçus pour l’immunofluorescence des ovocytes et des embryons de la perméabilisation et lavage ovocyte remplacé les tampons exclusifs. La perméabilisation, lavages et incubations avec amplificateur et sondes ont été réalisées en plaques 6 puits et ovocytes ont été placés sur des lames à la fin du protocole à l’aide de supports de montage. Ces modifications ont été en mesure de surmonter les limitations de la trousse disponible dans le commerce, en particulier, la lyse de l’ovocyte. Pour avec précision et de façon reproductible, compter le nombre des ARNm dans les ovocytes, logiciels a été utilisé. Ensemble, ce protocole représente une alternative à la PCR et séquençage de comparer l’expression des transcriptions précises dans des cellules individuelles.

Introduction

La transcriptase inverse amplification génique (PCR) a été l’étalon-or pour le dosage de l’ARNm. Deux essais, digital PCR (dPCR)1 et quantitative, real time PCR (qPCR)2 sont actuellement utilisés. De ces deux techniques PCR, dPCR a une plus grande sensibilité que qPCR suggérant qu’il pourrait être utilisé pour mesurer l’abondance d’ARNm dans les cellules. Toutefois, dans nos mains, dPCR analyse des ARNm de faible abondance dans les piscines de 5 à 10 ovocytes par chaque échantillon expérimental a produit des données avec faible reproductibilité et de la forte variation3. C’est probablement à cause de l’erreur expérimentale, associé à l’extraction de l’ARN et l’efficacité de la transcriptase inverse. Séquençage de RNA a également effectué à l’aide d’une seule souris et les ovocytes humains4,5. Cette technique requiert des étapes d’amplification de cDNA requis pour la génération de la bibliothèque qui augmente probablement la variabilité au sein d’un groupe expérimental. En outre, les transcriptions de faible abondance ne peuvent pas être détectables. Bien que les prix de séquençage ont baissé ces dernières années, il peut encore être coût prohibitif en raison du coût élevé des analyses bioinformatiques. Enfin, localisation de l’ARNm est un processus dynamique avec des changements spatiaux contribuant à la fonction de protéine6. Par conséquent, nous partîmes à adopter une technique qui produirait des mesures quantitatives précises et reproductibles et localisation des différents mRNAs dans les ovocytes unique.

ADN ramifié couplé à l’hybridation in situ fluorescence amplifie le signal de fluorescence plutôt qu’amplification RNA/cDNA habilitante détection seul ARNm dans les cellules individuelles 7,8,9. L’analyse est réalisée à travers une série d’hybridation, amplification (en utilisant l’ADN ramifié) et fluorescence d’étiquetage afin d’amplifier le signal de fluorescence7étapes. La technique commence par liaison de paires de sonde oligonucléotide de 18 à 25 la base qui sont complémentaires à un8,3,d’ARNm spécifiques10. Quinze à vingt paires de sonde sont conçues pour chaque spécificité de veiller à ce que de transcription pour la transcription de la cible. L’hybridation de l’ARNm spécifique est suivie d’un préamplificateur et amplificateur des sondes qui forment une configuration ramifiée. Environ 400 étiquette fluorophores lier à chaque amplificateur, résultant en une 8000-fold augmentation de fluorescence permettant la détection des différents mRNAs (Figure 1)11.

Figure 1
Figure 1 : schéma du protocole SM-poisson. Séquentielle hybridation d’une sonde spécifique de transcription, ramifiée amplificateur ADN et fluorophore vers une cible apparaît à l’ARNm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Des études antérieures utilisant des molécules simples fluorescence in situ hybridation (SM-FISH) localisée β-actine ARNm dans différents neurones12 et virus du papillome humain ADN dans le cancer du col utérin cellule lignes7. Les logiciels Spot trouver et Tracking Program identifie chaque signal fluorescent ponctuée et a été utilisé avec succès pour quantifier le nombre des ARNm dans chaque cellule3,13.

Selon les résultats de détection de l’ARNm dans les neurones12, nous avons supposé que SM-poisson s’avérera un outil utile pour quantifier les niveaux de transcription en murines ovocytes et d’embryons, y compris les ARNm de faible abondance. Cependant, la technique est optimisée pour une utilisation avec les cellules adhérentes fixes et formaldéhyde fixé paraffine intégrée des sections de tissu (FFIP). Ovocytes ne peuvent adhérer à une diapositive, même lorsqu’ils sont revêtus de la Poly-L-lysine. En outre, ils sont plus fragiles que les cellules somatiques et des sections de tissu ce qui entraîne la lyse des cellules lorsqu’elles sont soumises à certains des tampons exclusifs dans les kits disponibles dans le commerce3. Pour surmonter ces défis, les ovocytes ont été fixe et transférées manuellement entre les gouttes des tampons. En outre, tampons perméabilisation et de lavage dans les kits ont été remplacés pour réduire la lyse cellulaire. Sondes prédéfinis sont achetées aux côtés de la trousse de poissons ou des relevés de notes spécifiques peuvent être demandés. Chaque propriétaire de sonde est disponible dans l’un des trois canaux de fluorescence (C1, C2 et C3) permettant de multiplexage. Dans l’expérience actuelle, murins ovocytes étaient chiffrés à l’aide d’une sonde de C2 Nanog et une sonde de C3 Pou5f1 et double marquage. Ces sondes ont été choisis sur l’expression signalée de Nanog et Pou5f1 d’ovocytes et d’embryons. À l’issue de la procédure d’hybridation, ovocytes ont été placés en gouttes de supports de montage de l’anti-fondu pour application à histologiques. Images confocales ont été utilisées pour quantifier le nombre de signaux fluorescents ponctuées, qui représentent différents mRNAs. En plus de la quantification de l’ARNm, imagerie a également montré la distribution spatiale de l’ARNm spécifique dans la cellule, quelles autres méthodes de quantification ARN sont incapables d’atteindre. Cette technique s’est avérée pour avoir faible variabilité au sein d’un groupe expérimental permettant l’utilisation de plus petits nombres d’ovocytes dans chaque groupe expérimental afin d’identifier des différences significatives entre les groupes expérimentaux3.

Protocol

Procédures d’animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de l’urbanisme à l’Université de Nebraska-Lincoln et d’institutionnels animalier et toutes les méthodes ont été effectuées conformément aux règlements et aux lignes directrices pertinentes. Pour cette étude, tel CD-1 souris avaient accès ad libitum à chow rongeur normaux et de l’eau ; Ils ont été maintenues dans un 12:12 sombres : light cycle. 1. préparation du média requis Pour les supp…

Representative Results

À la fin du protocole, le résultat sera des images individuelles de confocal z-series (Figure 4 a et Figure 5), images piquées (Figure 4), et l’ARNm comtes (Figure 4 b). Lorsque le multiplexage est effectuée, il y aura aussi des images fusionnées montrant l’étiquette pour deux différents ARNm (<strong …

Discussion

Une série de mesures mineures pendant le protocole assurera succès fluorescence et comptages précis des ARNm. Tout d’abord, le protocole doit être effectué immédiatement après la collecte et la fixation des ovocytes. Notez que le PVP est ajoutée au tampon de fixation paraformaldéhyde à 4 % pour empêcher des ovocytes de coller les uns aux autres. Nous avons constaté qu’il est nécessaire réaliser l’expérience immédiatement après la collecte et la fixation des ovocytes. Tout retard entraîne un beauco…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Daniel R. Larson pour son aide généreuse avec l’installation et l’utilisation de la recherche de Spot et de Tracking Program 13 et l’appui technique de l’Université du Nebraska Lincoln microscopie Core pour l’imagerie de la microscopie confocale. Cette étude représente une contribution de l’Université du Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska et a été soutenue par des fonds de Hatch UNL (NEB-26-206/numéro d’ordre-232435 et NEB-26-231/numéro d’ordre-1013511).

Materials

(±)-α-Lipoic acid Sigma-Aldrich T1395 Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid MP Biomedicals, LLC 199899 FAF BSA
BD 10mL TB Syringe Becton, Dickinson and Company 309659 10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle Becton, Dickinson and Company 305109 27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 CaCl2-2H2O
Citric acid Sigma-Aldrich C2404 Citrate
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G6152 Glucose
Disodium phosphate Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish Falcon Corning 351008 35 mm dish
Edetate Disodium Avantor 8994-01 EDTA
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08 Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum Atlanta biologicals S10250 FBS
Gentamicin Reagent Solution gibco 15710-064 Gentamicin
GlutaMAX-I (100X) gibco 35050-061 Glutamax
Gold Seal Micro Slides Gold Seal 3039 25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum Sigma G4877 eCG
hCG recombinant NHPP AFP8456A hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes Sigma-Aldrich H3884 Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps Integra 17-305X Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid  MP Biomedicals, LLC 190228 L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich M2773 MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids Corning  25-025-Cl NEAA
Microscope Cover Glass Fisher Scientific 12-542-C 25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501891-C2 Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe Advanced Cell Diagnostics 501611-C3 Pou5f1 Probe
MOPS Sigma-Aldrich M3183
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile Millex-GP SLGP033RS 0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich P0930 PVP
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60128 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60218 KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent invitrogen P36934 Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI Advanced Cell Diagnostics 320858 DAPI
RNAscope FL AMP 1 Advanced Cell Diagnostics 320852 Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2 Advanced Cell Diagnostics 320853 Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3 Advanced Cell Diagnostics 320854 Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A Advanced Cell Diagnostics 320855 Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B Advanced Cell Diagnostics 320856 Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C Advanced Cell Diagnostics 320857 Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit Advanced Cell Diagnostics 320851 FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe Advanced Cell Diagnostics 320871 Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control Advanced Cell Diagnostics 320881 Positive Control
RNAscope Probe Diluent Advanced Cell Diagnostics 300041 Probe Diluent
RNAscope Protease III Advanced Cell Diagnositics 322337 Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics 322340 FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV Advanced Cell Diagnostics 322336 Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G Component Supply Co. NE-301PL-50 blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma-Aldrich S6191 NaCl
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 306576 NaOH
Sodium pyruvate, >= 99% Sigma-Aldrich P5280 Pyruvate
Solution 6 Well Dish Agtechinc D18 6 well dish
Taurine Sigma-Aldrich T8691 Taurine
Tissue Culture Dish Falcon Corning 353002 60 mm dish
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Triton X-100

References

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Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).

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