Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Kelsey  R. Timme; Jennifer R. Wood

doi:10.3791/59414

JoVE Journal > Genetics

Genetics

Brug af enkelt molekyle fluorescerende i Situ hybridisering (SM-fisk) til tal og Oversæt mRNAs i Murine oocyter

Published: April 24, 2019

doi:

10.3791/59414

Kelsey R. Timme, Jennifer R. Wood

¹Department of Animal Science,University of Nebraska-Lincoln

Summary

Hvis du vil reproducerbar tælle antallet af mRNAs i individuelle oocytter, enkelt molekyle RNA fluorescens in situ var hybridisering (RNA-fisk) optimeret til ikke-tilhænger celler. Oocytter blev indsamlet, hybridiseret med udskrift specifikke sonder og kvantificeres ved hjælp af et billede kvantificering software.

Abstract

Nuværende metoder, der rutinemæssigt anvendes til at kvantificere mRNA i oocytter og embryoner omfatter digitale reverse-transskription polymerase kædereaktion (dPCR), kvantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) og RNA sekvensering. Da disse teknikker er udført ved hjælp af en enkelt oocyt eller embryo, er lav-kopi mRNAs ikke pålideligt registreret. For at løse dette problem, kan æg eller embryoner samles sammen til analyse. men dette fører ofte til stor variation blandt prøver. I denne protokol beskriver vi brugen af fluorescens i situ hybridisering (FISH) ved hjælp af forgrenede DNA kemi. Denne teknik identificerer den rumlige mønster af mRNAs i individuelle celler. Når teknikken er kombineret med stedet at finde og spore computersoftware, kan overfloden af mRNAs i cellen også kvantificeres. Brug af denne teknik, der er nedsat variabilitet i en eksperimenterende gruppe og færre oocytter og embryoner er forpligtet til at påvise betydelige forskelle mellem eksperimentelle grupper. Kommercielt tilgængelige forgrenet DNA SM-fisk kits har været optimeret til at registrere mRNAs i sektioneret væv eller vedhængende celler på dias. Men oocyter effektivt overholder ikke dias og nogle reagenser i sættet var for hårdt, hvilket resulterer i oocyt lysering. For at forhindre denne lysis, blev flere ændringer foretaget til fisk kit. Specifikt, erstattet oocyt permeabilization og vask buffere designet til immunfluorescens af oocytter og embryoner leverandørejet bufferne. Permeabilization, vasker og inkubationer med sonder og forstærker blev udført i 6-godt plader og oocyter blev placeret på dias i slutningen af protokollen ved hjælp af montering medier. Disse ændringer var i stand til at overvinde begrænsningerne af den kommercielt tilgængeligt kit, navnlig oocyt lysering. For at præcist og reproducerbar tælle antallet af mRNAs i individuelle oocytter, blev computersoftware brugt. Sammen, repræsenterer denne protokol et alternativ til PCR og sekventering at sammenligne udtryk for specifikke udskrifter i enkelte celler.

Introduction

Reverse transkriptase Polymerasekædereaktionen (PCR) har været guldstandarden til mRNA-kvantificering. To assays, digital PCR (dPCR)¹ og kvantitative, real time PCR (qPCR)² bruges aktuelt. Af de to PCR teknikker har dPCR større følsomhed end qPCR tyder på, at det kunne bruges til at måle mRNA overflod i enkelte celler. Men i vores hænder, dPCR analyse af lav overflod mRNAs i puljer af 5 til 10 oocyter pr. hver eksperimentel prøve har produceret data med lav reproducerbarhed og høj variation³. Dette er sandsynligvis på grund af eksperimentelle fejl forbundet med RNA udvinding og reverse transkription effektivitet. RNA sekventering har også udført ved hjælp af en enkelt mus og menneskelige oocyter⁴^,⁵. Denne teknik kræver cDNA forstærkning trin, der kræves for den bibliotek generation, hvilket sandsynligvis øger variation inden for en eksperimentel musikgruppe. Endvidere må lav overflod udskrifter ikke kunne påvises. Selvom sekventering priser er gået ned de sidste par år, kan det stadig være omkostningseffektivt uoverkommelige på grund af de høje udgifter til Bioinformatik analyser. Endelig, mRNA lokalisering er en dynamisk proces med rumlige ændringer bidrager til protein funktion⁶. Derfor, vi satte sig for at vedtage en teknik, der vil producere nøjagtige og reproducerbare kvantitative foranstaltninger og lokalisering af individuelle mRNAs i enkelt oocyter.

Forgrenede DNA koblet til fluorescens i situ hybridisering forstærker fluorescens signal snarere end forstærkende RNA/cDNA muliggør påvisning af enkelt mRNAs i enkelte celler ⁷^,⁸^,⁹. Analysen udføres gennem en række hybridisering, forstærkning (ved hjælp af forgrenede DNA) og fluorescens mærkning skridt for at forstærke fluorescens signal⁷. Teknikken, der begynder med bindingen af 18 – 25 base oligonukleotid sonde-par, der supplerer en specifik mRNA³^,⁸^,¹⁰. Femten til tyve sonde par er designet til hver afskrift sikring specificitet for target udskrift. MRNA-specifikke hybridisering er efterfulgt af pre-forstærker og forstærker sonder, der danner et forgrenet konfiguration. Ca, 400 etiket fluorophores binder til hver forstærker, hvilket resulterer i en 8000-fold stigning i fluorescens giver mulighed for påvisning af individuelle mRNAs (figur 1)¹¹.

Figur 1: skematisk af SM-fisk protokol. Sekventiel hybridisering af udskrift specifikke sonde, forgrenet DNA forstærker og fluorophore til et mål mRNA er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tidligere undersøgelser ved hjælp af enkelt molekyle fluorescens i situ hybridisering (SM-fisk) lokaliseret β-actin mRNAs i individuelle neuroner¹² og humant papillomvirus DNA i livmoderhalskræft celle linjer⁷. Computersoftware stedet at finde og programmet til sporing af identificerer enkelte punktformet fluorescerende signal og held har været anvendt til at opgøre antallet af mRNAs i hver celle³^,¹³.

Baseret på resultaterne af mRNA påvisning i neuroner¹², hypotese vi at SM-fisk ville vise sig at være et nyttigt redskab til at kvantificere udskrift niveauer i murine oocytter og embryoner herunder lav overflod mRNAs. Men teknikken er optimeret til brug med vedhængende fast celler og formaldehyd fast paraffin indlejret (FFPE) væv sektioner. Oocyter kan ikke overholde et dias, selv når de er belagt med Poly-L-lysin. Derudover er de mere skrøbelige end somatiske celler og væv sektioner resulterer i celle lysis når de udsættes for nogle af leverandørejet bufferne i kommercielt tilgængelige kits³. For at overvinde disse udfordringer, oocyter fast og manuelt overført mellem dråber af buffere. Desuden blev permeabilization og vask buffere i kits udskiftet for at reducere celle lysering. Foruddesignede sonder er købt sammen med fisk kit eller specifikke udskrifter kan bestilles. Hver proprietære sonde sæt er tilgængelige i en af tre fluorescens kanaler (C1, C2 og C3) at tillade multiplexing. I den aktuelle eksperiment var murine oocyter dual-farvede og kvantificeret ved hjælp af en C2 Nanog sonde og en C3 Pou5f1 sonde. Disse prober blev udvalgt på baggrund af de rapporterede udtryk for Nanog og Pou5f1 i oocytter og embryoner. Ved afslutningen af hybridisering trin blev oocyter placeret i dråber af anti-fade montering medier for ansøgning til histologisk dias. Konfokal billeder blev brugt til at opgøre antallet af punktformet fluorescerende signaler, som repræsenterer individuelle mRNAs. Ud over at kvantificere mRNAs, imaging viste også den geografiske fordeling af den specifikke mRNA i cellen, er som andre RNA kvantificering metoder ude af stand til at opnå. Denne teknik vist sig for at have lav variation inden for en eksperimentel musikgruppe der tillader anvendelse af mindre antal oocyter i hver eksperimentelle gruppe for at identificere væsentlige forskelle mellem eksperimentelle grupper³.

Protocol

Animalske procedurer blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på University of Nebraska-Lincoln og alle metoder blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og forordninger. For denne undersøgelse, outbred CD-1 mus havde ad libitum adgang til normale gnaver chow og vand; de blev opretholdt i en 12:12 mørke: lys cyklus. 1. forberedelse af krævede medier Base medier (OMM), tilføje 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO<su…

Representative Results

Efter afslutningen af protokollen vil medføre enkelte billeder fra Konfokal z-serie (figur 4A og figur 5), syet billeder (fig. 4 c), og mRNA tæller (figur 4B). Når multiplexing er udført, vil der også være flettede billeder viser etiketten for to forskellige mRNAs (figur 5)</st…

Discussion

En række mindre trin under protokollen vil sikre vellykkede fluorescens og nøjagtige optællinger af mRNAs. Først skal protokollen udføres straks efter samling og fiksering af oocyter. Bemærk, at PVP er tilføjet til 4% PARAFORMALDEHYD fiksering buffer til at forhindre oocyter klistrer til hinanden. Vi fandt, at det er nødvendigt at udføre eksperimentet umiddelbart efter indsamling og fiksering af oocyter. Enhver forsinkelse resulterer i en meget lavere fluorescens signal, som ville resultere i undercounting af ud…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Daniel R. Larson for hans generøse hjælp med installation og brug af i stedet at finde og programmet til sporing af ¹³ og teknisk støtte fra University of Nebraska Lincoln mikroskopi kerne for konfokalmikroskopi billeddannelse. Denne undersøgelse er et bidrag af University of Nebraska landbrugs forskning Division, Lincoln, Nebraska og blev støttet af UNL Hatch midler (NEB-26-206/tiltrædelse af-232435 og NEB-26-231/tiltrædelse nummer-1013511).

Materials

(±)-α-Lipoic acid	Sigma-Aldrich	T1395	Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid	MP Biomedicals, LLC	199899	FAF BSA
BD 10mL TB Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659	10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Company	305109	27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	CaCl2-2H2O
Citric acid	Sigma-Aldrich	C2404	Citrate
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Glucose
Disodium phosphate			Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish	Falcon Corning	351008	35 mm dish
Edetate Disodium	Avantor	8994-01	EDTA
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum	Atlanta biologicals	S10250	FBS
Gentamicin Reagent Solution	gibco	15710-064	Gentamicin
GlutaMAX-I (100X)	gibco	35050-061	Glutamax
Gold Seal Micro Slides	Gold Seal	3039	25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum	Sigma	G4877	eCG
hCG recombinant	NHPP	AFP8456A	hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes	Sigma-Aldrich	H3884	Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps	Integra	17-305X	Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid	MP Biomedicals, LLC	190228	L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773	MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids	Corning	25-025-Cl	NEAA
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-C	25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe	Advanced Cell Diagnostics	501891-C2	Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe	Advanced Cell Diagnostics	501611-C3	Pou5f1 Probe
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile	Millex-GP	SLGP033RS	0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P0930	PVP
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60128	KCl
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	60218	KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent	invitrogen	P36934	Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI	Advanced Cell Diagnostics	320858	DAPI
RNAscope FL AMP 1	Advanced Cell Diagnostics	320852	Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2	Advanced Cell Diagnostics	320853	Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3	Advanced Cell Diagnostics	320854	Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A	Advanced Cell Diagnostics	320855	Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B	Advanced Cell Diagnostics	320856	Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C	Advanced Cell Diagnostics	320857	Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit	Advanced Cell Diagnostics	320851	FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe	Advanced Cell Diagnostics	320871	Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control	Advanced Cell Diagnostics	320881	Positive Control
RNAscope Probe Diluent	Advanced Cell Diagnostics	300041	Probe Diluent
RNAscope Protease III	Advanced Cell Diagnositics	322337	Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit	Advanced Cell Diagnostics	322340	FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV	Advanced Cell Diagnostics	322336	Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G	Component Supply Co.	NE-301PL-50	blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S6191	NaCl
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	306576	NaOH
Sodium pyruvate, >= 99%	Sigma-Aldrich	P5280	Pyruvate
Solution 6 Well Dish	Agtechinc	D18	6 well dish
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691	Taurine
Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002	60 mm dish
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Triton X-100

References

Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).
Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. . Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).
Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4 (2016).
Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).
Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, (2016).
Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).
Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15 (2003).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).