Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Kelsey  R. Timme; Jennifer R. Wood

doi:10.3791/59414

JoVE Journal > Genetics

Genetics

Bruk av ett molekyl fluorescerende i Situ hybridisering (SM-fisk) å kvantifisere og Localize mRNAs i Murine Oocytes

Published: April 24, 2019

doi:

10.3791/59414

Kelsey R. Timme, Jennifer R. Wood

¹Department of Animal Science,University of Nebraska-Lincoln

Summary

Du reproduserbar teller antallet mRNAs i individuelle oocytes, ett molekyl RNA fluorescens i situ var hybridisering (RNA-fisk) optimalisert for ikke-tilhenger celler. Oocytes var samlet, hybridiserte med transkripsjon bestemt sonder og kvantifisert bruker en kvantifisering programvare.

Abstract

Gjeldende metoder rutinemessig brukes å kvantifisere mRNA i oocytes og embryo inkluderer digitale omvendt-transkripsjon polymerasekjedereaksjons (dPCR), kvantitativ, real-time RT-PCR (RT-qPCR) og RNA sekvensering. Når disse teknikkene utføres ved hjelp av en enkelt oocytter og embryo, gjenkjennes lav-kopi mRNAs pålitelig ikke. Du løser dette problemet, kan oocytes eller embryo samordnes sammen for analyse; men fører dette ofte til høy variasjon blant prøver. I denne protokollen beskriver vi bruk av fluorescens i situ hybridisering (fisk) bruker forgrenet DNA kjemi. Denne teknikken identifiserer romlige mønster av mRNAs i enkeltceller. Når teknikken er kombinert med sted å finne og sporingsprogramvare, kan også overflod av mRNAs i cellen kvantifiseres. Bruker denne teknikken, det er redusert variasjon innen en forsøksgruppen og færre oocytes og embryo kreves for å gjenkjenne betydelige forskjeller mellom eksperimentelle grupper. Kommersielt tilgjengelige forgrenet-DNA SM-fisk kits er optimalisert for å oppdage mRNAs i valgte vev eller tilhenger celler i lysbilder. Men oocytes effektivt overholder ikke lysbilder og noen reagenser i kit var for harde resulterer i oocyte lysis. For å forhindre denne lyse, ble flere endringer gjort fisk Kit. Spesielt erstattet oocyte permeabilization og vask buffere designet for immunofluorescence av oocytes og embryo de proprietære bufferne. Den permeabilization, vasker og incubations med sonder og forsterker ble utført i 6-vel plater og oocytes ble plassert på lysbilder på slutten av protokollen bruker monterer medier. Disse endringene kunne overvinne begrensningene til kommersielt tilgjengelige settet, spesielt oocyte lysis. For å nøyaktig og reproduserbar telle antall mRNAs i individuelle oocytes, ble programvare brukt. Sammen, representerer denne protokollen et alternativ til PCR og sekvensering sammenligne uttrykk for bestemte utskrifter i enkeltceller.

Introduction

Revers transkriptase polymerasekjedereaksjons (PCR) har vært gullstandarden for mRNA kvantifisering. To analyser, digital PCR (dPCR)¹ og kvantitativ, virkelig tid PCR (qPCR)² brukes for øyeblikket. Av de to PCR teknikkene har dPCR større følsomhet enn qPCR antyder at det kan brukes til å måle mRNA overflod i enkeltceller. Men i våre hender, har dPCR analyse av lav overflod mRNAs i av 5 til 10 oocytes per hvert eksperimentelle utvalg produsert data med lav reproduserbarhet og høy variant³. Dette er sannsynligvis på grunn av eksperimentelle feil forbundet med RNA utvinning og omvendt transkripsjon effektivitet. RNA sekvensering er også utført med et enkelt museklikk og menneskelig oocytes⁴^,⁵. Denne teknikken krever cDNA forsterkning fremgangsmåtene for biblioteket generasjon som sikkert øker variasjonen i en forsøksgruppen. Videre kan lav overflod utskrifter ikke være synlig. Selv om sekvensering prisene har gått ned de siste årene, kan det likevel være kostnadseffektivt uoverkommelige på grunn av de høye kostnadene av bioinformatikk analyser. Endelig er mRNA lokalisering en dynamisk prosess med romlig endringer bidra til protein funksjon⁶. Derfor setter vi opp for vedta en teknikk som vil produsere nøyaktig og reproduserbar kvantitative tiltak og lokalisering av personlige mRNAs i én oocytes.

Forgrenede DNA koblet til fluorescens i situ hybridisering forsterker fluorescens signal i stedet for å forsterke RNA/cDNA aktivere gjenkjenning av ett mRNAs i enkeltceller ⁷^,⁸^,⁹. Analysen utføres gjennom en rekke hybridisering, forsterkning (med forgrenet DNA) og fluorescens merking skritt for å forsterke fluorescens signal⁷. Teknikken begynner med binding av 18 – til 25-base oligonucleotide sonde par som er komplementære til en bestemt mRNA³^,⁸^,¹⁰. Femten til tjue sonde parene er designet for hver utskrift sikre spesifisitet for målet transkripsjon. MRNA-spesifikke hybridization etterfølges av pre forsterker og forsterker sonder som danner en forgrenet konfigurasjon. Ca, 400 etiketten fluorophores binder seg til hver forsterker, resulterer i en 8000-fold økning i fluorescens tillater påvisning av individuelle mRNAs (figur 1)¹¹.

Figur 1: skjematisk av SM-fisk protokollen. Sekvensiell blanding av transkripsjon bestemt sonde, forgrenet DNA forsterker og fluorophore til et mål mRNA vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tidligere studier med ett molekyl fluorescens i situ hybridisering (SM-fisk) lokalisert β-utgangen mRNAs i individuelle neurons¹² og humant papillomavirus DNA i livmorhalskreft celle linjer⁷. Dataprogramvaren sted å finne og sporing programmet identifiserer individuelle vises punctate fluorescerende signal og har blitt brukt å tallfeste antallet mRNAs i hver celle³^,¹³.

Basert på resultatene av mRNA gjenkjenning i neurons¹², hypotese vi at SM-fisk ville bevise en nyttig verktøyet å quantitate transkripsjon nivåer i murine oocytes og embryo inkludert lav overflod mRNAs. Men teknikken er optimalisert for bruk med tilhenger fast celler og formaldehyd fast parafin innebygd (FFPE) vev deler. Oocytes kan ikke følge et lysbilde, selv når de er belagt med Poly-L-lysine. Videre, de er mer sårbar enn somatiske celler og vev inndelinger som resulterer i cellen lysis når utsatt for noen av proprietære bufferne i kommersielt tilgjengelig kits³. For å overvinne disse utfordringene, oocytes fast og manuelt overføres mellom dråper bufferne. Videre erstattet permeabilization og vask buffere i settene for å redusere celle lysis. Forhåndsutformede sonder kjøpes sammen med fisk kit eller bestemte utskrifter kan forespørres. Hver proprietære sonde er tilgjengelig i en av tre fluorescens kanaler (C1, C2 og C3) for å tillate multipleksing. I gjeldende eksperimentet var murine oocytes dual-farget og kvantifisert ved hjelp av en C2 Nanog sonde og en C3 Pou5f1 sonde. Disse sonder ble valgt basert på rapporterte uttrykk for Nanog og Pou5f1 i oocytes og embryo. Ved avslutningen av hybridisering trinnene plassert oocytes i dråper av anti-fade monterer medier skal histologiske lysbilder. AC confocal bilder ble brukt om å kvantifisere antall vises punctate fluorescerende signaler som representerer personlige mRNAs. Kvantifisere mRNAs, bildebehandling viste også den romlige fordelingen av den spesifikke mRNA i cellen, er hvilke andre RNA kvantifisering metoder ikke å oppnå. Denne teknikken vist seg for å ha lav variasjon innen en forsøksgruppen tillater bruk av mindre antall oocytes i hver forsøksgruppen å identifisere betydelige forskjeller mellom eksperimentelle grupper³.

Protocol

Animal prosedyrer blir gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen på University of Nebraska-Lincoln og alle metodene ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og regler. For denne studien, CD-1 outbred musene hadde ad lib tilgang til normal gnager chow og vann. de ble opprettholdt i en 12:12 mørke: lyset syklus. 1. utarbeidelse av nødvendige medier For basen medier (OMM), kan du legge 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4…

Representative Results

Ved ferdigstillelse av protokollen, vil resultatet være enkeltbilder fra AC confocal z-serien (figur 4A og figur 5), sydd bilder (figur 4C), og mRNA teller (figur 4B). Når multipleksing er utført, vil det også være sammenslåtte bilder viser etiketten for to ulike mRNAs (figur 5…

Discussion

En rekke mindre trinn under protokollen sikrer vellykket fluorescens og nøyaktig antall mRNAs. Protokollen må først utføres umiddelbart etter innsamling og fiksering av oocytes. Merk at PVP legges til 4% paraformaldehyde fiksering bufferen slik at oocytes henger sammen. Vi fant at det er nødvendig å utføre eksperimentet umiddelbart etter innsamling og fiksering av oocytes. Forsinkelser resulterer i en mye lavere fluorescens signal som vil føre til undercounting av transkripsjoner. Dette skyldes delvis RNA degrade…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Daniel R. Larson for hans sjenerøs hjelp med installasjon og bruk av sted å finne og sporing Program ¹³ og teknisk støtte fra University of Nebraska Lincoln mikroskopi kjernen for AC confocal mikroskopi avbilding. Denne studien representerer et bidrag på University of Nebraska Agricultural Research Division, Lincoln, Nebraska og ble støttet av UNL Luke midler (NB-26-206/tiltredelse-232435 og NB-26-231/tiltredelse-1013511).

Materials

(±)-α-Lipoic acid	Sigma-Aldrich	T1395	Alpha Lipoic Acid
Albumin, Bovine Serum, Low Fatty Acid	MP Biomedicals, LLC	199899	FAF BSA
BD 10mL TB Syringe	Becton, Dickinson and Company	309659	10 mL syringe
BD PrecisionGlide Needle	Becton, Dickinson and Company	305109	27 1/2 gauge needle
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902	CaCl2-2H2O
Citric acid	Sigma-Aldrich	C2404	Citrate
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Glucose
Disodium phosphate			Na2HPO4
Easy Grip Petri Dish	Falcon Corning	351008	35 mm dish
Edetate Disodium	Avantor	8994-01	EDTA
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08	Straight, Sharp/Sharp, non-serrated, 13mm cutting edge scissors
Fetal Bovine Serum	Atlanta biologicals	S10250	FBS
Gentamicin Reagent Solution	gibco	15710-064	Gentamicin
GlutaMAX-I (100X)	gibco	35050-061	Glutamax
Gold Seal Micro Slides	Gold Seal	3039	25 x 75mm slides
Gonadotropin, From Pregnant Mares' Serum	Sigma	G4877	eCG
hCG recombinant	NHPP	AFP8456A	hCG
Hyaluronidase, Type IV-S: From Bovine Testes	Sigma-Aldrich	H3884	Hyaluronidase
Jewelers Style Forceps	Integra	17-305X	Forceps 4-3/8", Style 5F, Straight, Micro Fine Jaw
L-(+)-Lactic Acid, free acid	MP Biomedicals, LLC	190228	L-Lactate
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773	MgSO4-7H2O
MEM Nonessential Amino Acids	Corning	25-025-Cl	NEAA
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-C	25 x 25x 0.15 mm cover slips
Mm-Nanog-O2-C2 RNAscope Probe	Advanced Cell Diagnostics	501891-C2	Nanog Probe
Mm-Pou5f1-O1-C3 RNAscope Probe	Advanced Cell Diagnostics	501611-C3	Pou5f1 Probe
MOPS	Sigma-Aldrich	M3183
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Paraformaldehyde
PES 0.22 um Membrane -sterile	Millex-GP	SLGP033RS	0.22 um filters
Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P0930	PVP
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	60128	KCl
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	60218	KH2PO4
Prolong Gold antifade reagent	invitrogen	P36934	Antifade reagent without DAPI
RNAscope DAPI	Advanced Cell Diagnostics	320858	DAPI
RNAscope FL AMP 1	Advanced Cell Diagnostics	320852	Amplifier 1
RNAscope FL AMP 2	Advanced Cell Diagnostics	320853	Amplifier 2
RNAscope FL AMP 3	Advanced Cell Diagnostics	320854	Amplifier 3
RNAscope FL AMP 4 ALT A	Advanced Cell Diagnostics	320855	Amplifier 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT B	Advanced Cell Diagnostics	320856	Amplifier 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT C	Advanced Cell Diagnostics	320857	Amplifier 4 ALT C
RNAscope Fluorescent Multiplex Detection Reagents Kit	Advanced Cell Diagnostics	320851	FISH Reagent Kit
RNAscope Probe 3-plex Negative Control Probe	Advanced Cell Diagnostics	320871	Negative Control
RNAscope Probe 3-plex Positive Control	Advanced Cell Diagnostics	320881	Positive Control
RNAscope Probe Diluent	Advanced Cell Diagnostics	300041	Probe Diluent
RNAscope Protease III	Advanced Cell Diagnositics	322337	Protease III
RNAscope Protease III & IV Reagent Kit	Advanced Cell Diagnostics	322340	FISH Protease Kit
RNAscope Protease IV	Advanced Cell Diagnostics	322336	Protease IV
S/S Needle with Luer Hub 30G	Component Supply Co.	NE-301PL-50	blunt 30 gauge needle
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6297	NaHCO3
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S6191	NaCl
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	306576	NaOH
Sodium pyruvate, >= 99%	Sigma-Aldrich	P5280	Pyruvate
Solution 6 Well Dish	Agtechinc	D18	6 well dish
Taurine	Sigma-Aldrich	T8691	Taurine
Tissue Culture Dish	Falcon Corning	353002	60 mm dish
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Triton X-100

References

Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930 (2018).
Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. . Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , 1-5 (2016).
Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4 (2016).
Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459 (2017).
Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, (2016).
Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855 (2010).
Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15 (2003).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Timme, K. R., Wood, J. R. Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes. J. Vis. Exp. (146), e59414, doi:10.3791/59414 (2019).