מודל מבחנה של אנגיוגנזה כלילית
Summary
במודלים של בעלי מבחנה של אנגיוגנזה כלילית ניתן לעשות שימוש לגילוי המנגנון הסלולר והמולקולרי של אנגיוגנזה כלילית. באופן מתורבת תרבויות של הסינוס venosus ורקמות אנדוקרדיום להראות צמיחה חזקה בתגובה ל-ולהציג דפוס דומה של הביטוי הפיכה-TFII כמו ב vivo.
Abstract
כאן, אנו מתארים בתוך שיטת תרבות מבחנה לחקר אנגיוגנזה כלילית. כלי דם כליליים מזינים את שריר הלב והינם בעלי חשיבות קלינית. פגמים בכלי זה מייצגים סיכונים בריאותיים חמורים כגון טרשת עורקים, אשר יכול להוביל שריר הלב infarctions וכישלונות לב בחולים. כתוצאה מכך, מחלת עורק כלילית היא אחת הסיבות המובילות בעולם למוות. למרות החשיבות הקלינית שלה, התקדמות קטנה יחסית נעשתה על איך לחדש את העורקים הכליליים פגום. אף על פי כן, ההתקדמות האחרונה נעשתה בהבנת המקור הסלולר ומסלולי הבידול של פיתוח כלי קיבול כלילית. הופעתו של כלים וטכנולוגיות המאפשרים לחוקרים לתייג באופן מרשים בתאי קדמון, לעקוב אחר גורלם, ולהמחיש progenies בvivo היתה אינסטרומנטלית בהבנת התפתחות כלי הקיבול כלילית. במחקרים vivo הם יקרי ערך, אך יש להם מגבלות מבחינת מהירות, נגישות וגמישות בתכנון ניסיוני. לחילופין, מדויק במודלים מחוץ לגוף של אנגיוגנזה כלילית יכול לעקוף מגבלות אלה ולאפשר לחוקרים לחקור שאלות ביולוגיות חשובות במהירות ובגמישות. חוסר ההתאמה במערכות מודל החוץ-גופית עלול להיות מפריע להתקדמות בהבנת המנגנון הסלולר והמולקולרי של צמיחת כלי קיבול כלילית. כאן, אנו מתארים מערכת תרבות מבחנה לגדל כלי כלילית מן venosus סינוס (SV) ו אנדוקרדיום (אנדו), שתי רקמות הקדמון שממנו רבים של כלי כלילית להתעורר. כמו כן, אנו מאשרים כי התרבויות באופן מדויק לכידה של חלק הידוע במנגנונים vivo. למשל, אנו מראים כי נבטי האנגיוגנטי בתרבות מ-SV הפחתת הפיכה-TFII הביטוי דומה למה שנצפה ב vivo. בנוסף, אנו מראים כי מרכיב ה-אנגיוf-A, גורם מוכר היטב בvivo, מעורר את האנגיוגנזה הן מתרבויות הSV והן מתרביות האנדו. באופן קולקטיבי, המציאו מודל מדויק של תרבות מבחנה לחקר אנגיוגנזה כלילית.
Introduction
כלי הדם של הלב נקראים בדרך כלל כלי דם כליליים. כלי הדם מורכבים מעורקים, עורקים ונימים. במהלך פיתוח, נימים מאוד מסוקנים מבוססים על הראשון, אשר לאחר מכן לשפץ לתוך עורקים וורידים כליליים1,2,3,4,5. הנימים הראשוניים האלה בנויים מתאי מחולל שורש שנמצאו בתוך הפרואפידיום, הסינוס venosus (SV), ו אנדוקרדיום (אנדו) רקמות1,6,7,8. SV הוא האיבר הנכנס של הלב העובריים ואנדו הוא הציפוי הפנימי של הלב לומן. תאי מחולל שורש שנמצאו ב-SV ו-אנדו בונים את רוב העורקים הכליליים, ואילו הפרואפידיום תורמת לחלק קטן יחסית ממנו2. התהליך בו הרשת הקפילר של כלי הדם הכליליים גדלים בלב התאים הקודמיים הקיימים נקראת אנגיוגנזה כלילי. מחלת עורק כלילית היא אחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם, ובכל זאת, טיפול יעיל למחלה זו חסר. הבנת המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים המפורטים באנגיוגנזה כלילית יכולים להועיל בעיצוב הטיפולים החדשניים והיעילים לתיקון ולחידוש העורקים הכליליים שנפגעו.
לאחרונה, גל ההבנה שלנו כיצד מתפתחים כלי קיבול כליליים הושג באופן חלקי באמצעות פיתוח כלים וטכנולוגיות חדשים. בפרט, בשנת vivo התוויות היוחסין וטכנולוגיות הדמיה מתקדמות שימושי מאוד לחשוף את המקור הסלולר בידול מסלולים של כלי כלילית9,10,11,12. למרות היתרונות של אלה בכלים vivo, קיימות מגבלות במונחים של מהירות, גמישות ונגישות. לכן, מערכות מודל מבחנה חזקות יכולות להשלים במערכות vivo כדי להבהיר את המנגנונים הסלולאריים והמולקולריים של אנגיוגנזה כלילית בצורה של תפוקה גבוהה.
כאן, אנו מתארים מודל מתורבת של אנגיוגנזה כלילית. פיתחנו מערכת תרבות התפתחות מחוץ גופית כדי לגדל כלי קיבול כלילית משני רקמות קדמון, SV ו אנדו. עם המודל הזה, אנו מראים כי ברקמות הרקמה מחוץ למוח החוקר לגדול ניצנים כלילית כאשר מגורה על ידי מדיום הצמיחה. בנוסף, תרבויות ההסבר גדלות במהירות בהשוואה לשליטה בזמן הגירוי על ידי גורם הגדילה של כלי הדם A (“וואפ-א”), חלבון אנגיוגנטי חזק במיוחד. יתרה מזאת, גילינו כי נבטי האנגיוגנטית מתרבות ה-SV עוברים הבחנה ורידים (אובדן הבעת ההפיכה-TFII), מנגנון הדומה לאנגיוגנזה של SV ב-vivo1. נתונים אלה מצביעים על כך שמערכת התרבות התרבותית של החברה ממריצה בנאמנות אירועים של אנגיוגנטי המתרחשים בvivo. באופן קולקטיבי, במודלים של האנגיוגנזה המתוארים כאן, הם אידיאליים לבדיקה של מנגנונים סלולאריים ומולקולריים של אנגיוגנזה כלילית בצורה של תפוקה גבוהה ונגישה.
Protocol
Representative Results
Discussion
חלק מהצעדים הקריטיים ביותר לגידול בהצלחה באוניות כלילית מתוך הרקמות SV ו-אנדו הם: 1) זיהוי נכון ובידוד רקמת SV עבור תרבות SV; 2) שימוש בחללי החדרים מעוברים בין הגילאים e11-11.5 לתרבות אנדו מדויקת; 3) שמירה על תנאים סטריליים לאורך תקופת הניתוח ושמירה על הרקמות קרות בכל עת; ו 4) שמירה על explants מחוברים קרו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לחברי מעבדת שארמה על מתן סביבת מחקר תומכת. אנו אוהבים להאריך תודה מיוחדת לדיאן (די) ר. הופמן ששומר ודואג למושבת העכברים שלנו. אנחנו גם רוצים להודות לג פיליפ הSmaldino וקרולין ואן על הגהה יסודית של כתב היד והענקת הערות מועילות. עבודה זו הייתה נתמכת על ידי קרנות מהמשרד הראשי של האוניברסיטה הממלכתית ומחלקת הביולוגיה של B. S, אינדיאנה האקדמיה למדעים מחקר בכיר מענקים כספים ל-B. S, ו-NIH (RO1-HL128503) ואת הקרן ניו יורק גזע תא קרנות כדי K.R.
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
