Method Article

冠動脈血管新生のインビトロモデル

DOI:

10.3791/60558

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March 10th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Ball State University, 2Department of Biology, Stanford University

In This Article

Summary

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冠状血管新生のインビトロモデルは、冠状血管新生の細胞および分子機構の発見に利用することができる。静脈内および心内膜組織のインビトロ外植培養はVEGF-Aに応答して強固な成長を示し、in vivoと同様のCOUP-TFII発現パターンを示す。

Abstract

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ここでは冠状血管新生を研究するためのインビトロ培養アッセイについて述べる。冠状血管は心臓の筋肉を養い、臨床的に重要です。これらの血管の欠陥は、アテローム性動脈硬化症などの深刻な健康上のリスクを表し、患者の心筋梗塞や心不全を引き起こす可能性があります。その結果、冠状動脈疾患は、世界中の主要な死因の1つである。臨床的に重要であるにもかかわらず、損傷した冠状動脈を再生する方法について比較的少し進歩が見られた。しかしながら、冠状血管の発達の細胞起源と分化経路の理解において最近の進歩が見られた。研究者が前駆細胞に蛍光標識し、その運命に従い、生体内の子孫を視覚化することを可能にするツールと技術の出現は、冠状血管の発達を理解するのに役立っています。インビボ研究は貴重ですが、実験設計における速度、アクセシビリティ、柔軟性の面で限界があります。あるいは、冠状動脈血管新生の正確なin vitroモデルは、これらの限界を回避し、研究者が速度と柔軟性を持つ重要な生物学的質問を尋問することを可能にする。適切なin vitroモデルシステムの欠如は、冠状血管の成長の細胞および分子機構の理解の進展を妨げている可能性があります。ここでは、冠状血管の多くが生じる2つの前駆体組織である静脈内静脈(SV)および心内膜(Endo)から冠状血管を成長させるインビトロ培養システムについて説明する。また、この文化が既知のin vivoメカニズムの一部を正確に再現していることも確認した。例えば、SV由来の培養中の血管新生は、生体内で観察されるものと同様のCOUP-TFII発現を下方制御することを示す。また、VEGF-Aは、生体内の血管新生因子として知られており、SV培養および遠東培養の両方から血管新生を強く刺激することを示す。全体として、冠状動脈血管新生を研究するための正確なインビトロ培養モデルを考案しました。

Introduction

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心臓の血管は一般に冠状血管と呼ばれる。これらの血管は、動脈、静脈、および毛細血管で構成されています。開発中、高度に分岐した毛細血管が最初に確立され、その後、冠状動脈と静脈1、2、3、4、5に改造されます。これらの初期毛細血管は、プロエピカルジウム、静脈内静脈(SV)、および内心内膜(遠心内膜)組織1、6、7、8に見られる内皮前駆細胞から構築される。SVは胚性心臓の流入器官であり、心内腔の内層である。SVおよびEndoに見られる内皮前駆細胞は冠動脈脈管系の大部分を構築し、一方、プロエピカルジウムはその比較的小さな部分に寄与する2。冠状血管の毛細血管ネットワークが心臓に存在する前駆細胞から成長する過程を冠状血管新生と呼びます。冠動脈疾患は、世界的に主要な死因の1つであり、まだこの疾患に対する効果的な治療法は欠けて....

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Protocol

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このプロトコルですべての動物の使用は、ボール州立大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)ガイドラインに従いました。

1. マウスブリーダーの確立と、時を取った妊娠のための膣プラグの検出

  1. 野生型の雄と雌のマウスでマウスの繁殖ケージを設定します。飼育マウスの年齢が6-8週間の間であることを確認してください。ペア(1雄と1メス)またはトリオ(1オスと2メス)として繁殖を設定します。
  2. 翌朝、膣プラグを確認してください。斜めの金属プローブを使用して、膣の開口部に挿入して深いプラグを検出します。陽性膣プラグの朝を胚の日0.5(e0.5)に指定する。
    注: 膣プラグは、表面的(図1を参照)または深い(簡単には見えない)のいずれかです。深いプラグの存在は、プローブの完全な挿入をブロックしますが、プラグの欠如は抵抗なしで完全に挿入することができます。
  3. 胚が収穫されるe11.5に達するまで、時限妊娠を維持する。胚を収穫する前に妊娠を確認するには、e7.5とe11.5の間の雌マウスの体重を記録する。
    注:母親の体重の毎日の増加は、成功した妊娠を示しますが、体重の変化は妊娠の失敗を示しません。

2. 妊娠中マウスからの胚の収穫

注:始める前に、次....

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Results

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生体内のSV血管新生の最も顕著な特徴の1つは、特定の経路に従い、ステレオタイプの時間と位置1で起こる細胞脱分化および再分化事象を伴うことである。初期SV細胞が心室に成長するにつれて、それらはCOUP-TFIIのような静脈マーカーの産生を停止する(図7)。その後、冠状動脈芽は、心臓の表面または心筋内の深い2つの移動経路を取る。表面血管は最終的に静脈となり、血管は動脈と毛細血管1、6、7になります。この区別は、心臓が成長し、冠状動脈血管系が拡大するにつれて保存されます。

冠状動脈開発の分子基盤の発見を容易にするために、機能喪失および機能獲得実験に利用できるSV発芽の.......

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Discussion

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SVおよび遠親組織から冠状血管を正常に成長させるための最も重要なステップのいくつかは次のとおりです: 1) SV培養のためのSV組織を正しく同定し、単離する;2)正確な遠心培養のためにe11-11.5の年齢の間の胚からの心室を使用する。3)解剖期間を通じて無菌状態を維持し、常に組織を冷たく保つ;4)培地に浮遊する組織を避けるために、ECM被覆膜に付着した外植体を維持する。

まず、SV組織の単離は困難な場合があります。SVは、肺小葉の中に隠された左心房と右心房の間の心臓の後側にあることを認識することが重要です。そのため、分離および分離することが困難である。代わりに、心臓/肺の摘み取り全体を最初に抽出する必要があります。SVは、慎重に肺の小葉を除去し、微細な鉗子の助けを借りて隣接する組織をクリーンアップすることによって摘み取りから分離されます。さらに、SVを失わないように隣接する組織をクリーンアップする際には、非常に注意する必要があります。

第二に、正確な心内心血管新生のためには、e11.5より古い胚から心室を培養することが重要で.......

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Disclosures

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著者らは利益相反を宣言しない。

Acknowledgements

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著者らは、支援的な研究環境を提供してくれたシャルマ研究所のメンバーに感謝する。私たちは、私たちのマウスのコロニーを維持し、世話をするダイアン(ディー)R.ホフマンに特別な感謝を拡張したいと思います。また、フィリップ・J・スマルディーノ博士とキャロリン・ヴァン博士が原稿を徹底的に校正し、有益なコメントを提供してくれたことに感謝します。この研究は、ボール州立大学プロボスト事務所と生物学部からB.S.、インディアナ科学アカデミーシニアリサーチ補助金のB.S、NIH(RO1-HL128503)、ニューヨーク幹細胞財団からK.R.への資金によって支えられました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 x 20 MM 組織培養ディッシュフィッシャー・サイエンティフィック877222プロトコルではペトリ皿
24ウェルプレートフィッシャー・サイエンティフィック08-772-51
8.0 uM PET膜培養インサートミリポア・シグマ MCEP24H48
アレクサ フロー・ロバ・アンチウサギ 555フィッシャー・サイエンティフィックA31572二次抗体
アレクサFluor Donkey 抗ラット 488Fisher ScientificA21206二次抗体
角度付き金属プローブファインサイエンスツール10088-15角度付き 45°、深いプラグの検出に使用
抗ERG 1/2/3抗体アブカムAb92513一次抗体
抗VE-カドヘリン抗体フィッシャーサイエンティフィBDB550548 一次抗体、メーカー BD BioSciences
CO2 ガスタンク各種供給者N/A
CO2 インキュベーターフィッシャー サイエンティフィック13998223For 37 °C、5% CO2インキュベーション
解剖実体マイクロソープライカS9iライカ S9i 実体顕微鏡
EBM-2 基礎培地ロンザCC-3156内皮細胞増殖 基礎培地
ECM 溶液コーニング354230マトリゲル
EGM-2 MV シングルクォーツキットロンザCC-4147微小血管内皮細胞サプリメントキット;これはEBM-2に混合されてEGM-2完全な媒体を作るために
ウシ胎児血清 (FBS)フィッシャーサイエンティフィックSH3007003IR
FiJiNIHNA画像処理ソフトウェア (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
ファイン鉗子ファインサイエンスツール11412-11胚に使用されます解剖
フィッシャーブランド ストレートブレード 操作ハサミフィッシャーサイエンティフィック13-808-4
ヒクロンリン酸緩衝生理食塩水 (1X)フィッシャーサイエンティフィックSH-302-5601LR
層流組織培養フードフィッシャーサイエンティフィック様々なモデルが利用可能
マウント メディアベクターラボラトリーズH-1200DAPI付きベクタシールド
パラホルムアルデヒド(PFA)電子顕微鏡法/フィッシャー50-980-494これは32%で利用可能です;4%に希釈する必要があります
穴あきスプーンファインサイエンスツール10370-18溶液から胚/組織を除去するのに便利
組換えマウスVEGF-A 165PeproTech450-32
標準鉗子、デュモン #5ファインサイエンスツール11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamberEasysystemincEZ-1785安楽死チャンバー
・サイエンティフィック・サイエンティフィック ック

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
  2. Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. ....

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