冠動脈血管新生のインビトロモデル
Summary
冠状血管新生のインビトロモデルは、冠状血管新生の細胞および分子機構の発見に利用することができる。静脈内および心内膜組織のインビトロ外植培養はVEGF-Aに応答して強固な成長を示し、in vivoと同様のCOUP-TFII発現パターンを示す。
Abstract
ここでは冠状血管新生を研究するためのインビトロ培養アッセイについて述べる。冠状血管は心臓の筋肉を養い、臨床的に重要です。これらの血管の欠陥は、アテローム性動脈硬化症などの深刻な健康上のリスクを表し、患者の心筋梗塞や心不全を引き起こす可能性があります。その結果、冠状動脈疾患は、世界中の主要な死因の1つである。臨床的に重要であるにもかかわらず、損傷した冠状動脈を再生する方法について比較的少し進歩が見られた。しかしながら、冠状血管の発達の細胞起源と分化経路の理解において最近の進歩が見られた。研究者が前駆細胞に蛍光標識し、その運命に従い、生体内の子孫を視覚化することを可能にするツールと技術の出現は、冠状血管の発達を理解するのに役立っています。インビボ研究は貴重ですが、実験設計における速度、アクセシビリティ、柔軟性の面で限界があります。あるいは、冠状動脈血管新生の正確なin vitroモデルは、これらの限界を回避し、研究者が速度と柔軟性を持つ重要な生物学的質問を尋問することを可能にする。適切なin vitroモデルシステムの欠如は、冠状血管の成長の細胞および分子機構の理解の進展を妨げている可能性があります。ここでは、冠状血管の多くが生じる2つの前駆体組織である静脈内静脈(SV)および心内膜(Endo)から冠状血管を成長させるインビトロ培養システムについて説明する。また、この文化が既知のin vivoメカニズムの一部を正確に再現していることも確認した。例えば、SV由来の培養中の血管新生は、生体内で観察されるものと同様のCOUP-TFII発現を下方制御することを示す。また、VEGF-Aは、生体内の血管新生因子として知られており、SV培養および遠東培養の両方から血管新生を強く刺激することを示す。全体として、冠状動脈血管新生を研究するための正確なインビトロ培養モデルを考案しました。
Introduction
心臓の血管は一般に冠状血管と呼ばれる。これらの血管は、動脈、静脈、および毛細血管で構成されています。開発中、高度に分岐した毛細血管が最初に確立され、その後、冠状動脈と静脈1、2、3、4、5に改造されます。これらの初期毛細血管は、プロエピカルジウム、静脈内静脈(SV)、および内心内膜(遠心内膜)組織1、6、7、8に見られる内皮前駆細胞から構築される。SVは胚性心臓の流入器官であり、心内腔の内層である。SVおよびEndoに見られる内皮前駆細胞は冠動脈脈管系の大部分を構築し、一方、プロエピカルジウムはその比較的小さな部分に寄与する2。冠状血管の毛細血管ネットワークが心臓に存在する前駆細胞から成長する過程を冠状血管新生と呼びます。冠動脈疾患は、世界的に主要な死因の1つであり、まだこの疾患に対する効果的な治療法は欠けている。冠状動脈形成の詳細な細胞および分子メカニズムを理解することは、損傷した冠状動脈を修復し再生するための新しい効果的な治療法を設計するのに役立ちます。
最近、新しいツールや技術の開発を通じて、冠状血管がどのように発達していくのか、私たちの理解が急増しています。特に、生体内系統標識および高度なイメージング技術は、冠状血管9、10、11、12の細胞起源および分化経路を明らかにする上で非常に有用であった。これらの in vivo ツールの利点にもかかわらず、速度、柔軟性、およびアクセシビリティの点では制限があります。したがって、堅牢なin vitroモデルシステムは、高スループットの方法で冠状血管新生の細胞および分子機構を解明するために生体内システムを補完することができる。
ここでは冠状血管新生のインビトロモデルについて述べる。SVと遠島の2つの前駆体組織から冠状血管を成長させるインビトロ外植培養システムを開発しました。このモデルを用いて、インビトロ組織外植培養物が成長培地によって刺激されると冠状血管芽を増殖することを示す。さらに、外植培養物は、血管内皮増殖因子A(VEGF-A)によって刺激された制御に比べて急速に成長し、非常に強力な血管新生タンパク質である。さらに、SV培養物からの血管新生芽は静脈脱分化(COUP-TFII発現の喪失)を受け、生体内のSV血管新生と同様のメカニズムであることがわかった。これらのデータは、インビトロ外植物培養システムが生体内で起こる血管新生事象を忠実に復活させることを示唆している。総称して、ここで説明する血管新生のインビトロモデルは、高スループットでアクセス可能な方法で冠状血管新生の細胞および分子機構を探査するのに理想的である。
Protocol
Representative Results
Discussion
SVおよび遠親組織から冠状血管を正常に成長させるための最も重要なステップのいくつかは次のとおりです: 1) SV培養のためのSV組織を正しく同定し、単離する;2)正確な遠心培養のためにe11-11.5の年齢の間の胚からの心室を使用する。3)解剖期間を通じて無菌状態を維持し、常に組織を冷たく保つ;4)培地に浮遊する組織を避けるために、ECM被覆膜に付着した外植体を維持する。
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、支援的な研究環境を提供してくれたシャルマ研究所のメンバーに感謝する。私たちは、私たちのマウスのコロニーを維持し、世話をするダイアン(ディー)R.ホフマンに特別な感謝を拡張したいと思います。また、フィリップ・J・スマルディーノ博士とキャロリン・ヴァン博士が原稿を徹底的に校正し、有益なコメントを提供してくれたことに感謝します。この研究は、ボール州立大学プロボスト事務所と生物学部からB.S.、インディアナ科学アカデミーシニアリサーチ補助金のB.S、NIH(RO1-HL128503)、ニューヨーク幹細胞財団からK.R.への資金によって支えられました。
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
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