冠状血管生成体模型
Summary
冠状血管生成体外模型可用于发现冠状血管生成细胞和分子机制。正月线和内卡组织体外外培养物在响应VEGF-A时表现出强劲的生长，并表现出与体内类似的COUP-TFII表达模式。
Abstract
在这里，我们描述了一个体外培养测定，以研究冠状血管生成。冠状血管喂养心肌，是临床上重要的。这些血管的缺陷代表严重的健康风险，如动脉粥样硬化，这可能导致心肌梗死和心脏衰竭的患者。因此，冠状动脉疾病是全世界死亡的主要原因之一。尽管它具有临床重要性，但如何再生受损的冠状动脉进展甚微。然而，最近在了解冠状血管发育的细胞起源和分化途径方面取得了进展。使研究人员能够荧光标记后代细胞、跟踪后代命运和想象体内后代的工具和技术的出现，有助于理解冠状血管的发展。体内研究很有价值，但在速度、可访问性和实验设计的灵活性方面却有局限性。或者，准确的冠状血管生成体外模型可以规避这些限制，使研究人员能够快速灵活地询问重要的生物学问题。缺乏适当的体外模型系统可能妨碍了理解冠状血管生长细胞和分子机制的进展。在这里，我们描述了一个体外培养系统，从心内膜（SV）和内膜（Endo）生长冠状血管，这是许多冠状血管产生的两个祖组织。我们还确认，这些文化准确地概括了一些已知的体内机制。例如，我们表明，SV培养中的血管生成芽与体内观察到的类似，对COUP-TFII的表达进行低调节。此外，我们显示VEGF-A，一个众所周知的血管生成因子在体内，有力地刺激血管生成从SV和Endo培养。总体而言，我们设计了一个精确的体外培养模型来研究冠状血管生成。
Introduction
心脏的血管通常被称为冠状血管。这些血管由动脉、静脉和毛细血管组成。在开发过程中，先建立高度分支毛细血管，然后改造成冠状动脉和静脉1、2、3、4、5。这些初始毛细血管由在上皮管、正肠（SV）和内卡（Endo）组织1、6、7、8中发现的内皮祖细胞构建而成。SV是胚胎心脏的流入器官，内核是心脏流明的内衬。在SV和Endo中发现的内皮原细胞建立大部分的冠状血管，而外皮心肌贡献了相对小部分2。冠状血管毛细血管网络从先前存在的前体细胞在心脏中生长的过程称为冠状血管生成。冠状动脉疾病是全世界死亡的主要原因之一，然而，这种病却缺乏有效的治疗方法。了解冠状动脉生成的详细细胞和分子机制，对于设计修复和再生受损的冠状动脉的新颖有效的疗法非常有用。
最近，我们对冠状血管如何发展的认识激增，部分是通过开发新的工具和技术实现的。特别是，在体内系系标签和先进的成像技术在发现冠状血管9、10、11、12的细胞起源和分化途径方面非常有用。尽管这些在体内工具的优点，但在速度、灵活性和可访问性方面还是有局限性的。因此，强大的体外模型系统可以补充体内系统，以高通量的方式阐明冠状血管生成细胞和分子机制。
在这里，我们描述了冠状动脉成因的体外模型。我们开发了一种体外外培养系统，从两个祖组织SV和Endo生长冠状血管。通过这个模型，我们表明体外组织外植培养体生长冠状血管芽时，刺激生长介质。此外，在血管内皮生长因子A（VEGF-A）刺激时，外植培养物与对照生长迅速，这是一种高效力的血管生成蛋白。此外，我们发现，来自SV培养的血管生成芽经历静脉分化（COUP-TFII表达的丧失），这种机制类似于体内的SV血管生成。这些数据表明，体外外植物培养系统忠实地恢复了体内发生的血管生成事件。总之，此处描述的血管生成体外模型非常适合以高通量和可访问的方式探测冠状血管生成细胞和分子机制。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功生长SV和内部原组织冠状血管的一些最关键的步骤是：1） 正确识别和隔离SV组织，用于SV培养;2） 使用e11~11.5年龄之间的胚胎心室，获得准确的恩多培养;3） 在整个解剖期间保持无菌状态，并始终保持组织冷;和4） 保持外植附在ECM涂层膜上，以避免组织漂浮在介质中。
首先，分离SV组织可能具有挑战性。重要的是要认识到，SV位于隐藏在肺卵管内的左右心的背侧。因此，很…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢夏尔马实验室的成员提供了支持性的研究环境。我们特别感谢黛安（迪）R.霍夫曼谁维护和关心我们的老鼠群。我们还要感谢菲利普·斯马尔迪诺博士和卡罗琳·范恩博士对手稿进行彻底校对，并提出有益的评论。这项工作得到了鲍尔州立大学教务长办公室和生物学系对B.S、印第安纳科学院高级研究补助金基金和NIH（RO1-HL128503）和纽约干细胞基金会向K.R.提供资金的资助。
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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