In Vitro Modell der koronaren Angiogenese
Summary
In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese können für die Entdeckung der zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese verwendet werden. In-vitro-Explantationskulturen von Sinusvenosus und Endokardgewebezeigen weisen als Reaktion auf VEGF-A ein robustes Wachstum auf und weisen ein ähnliches Muster der COUP-TFII-Expression auf wie in vivo.
Abstract
Hier beschreiben wir einen In-vitro-Kulturtest zur Untersuchung der koronaren Angiogenese. Herzkranzgefäße ernähren den Herzmuskel und sind von klinischer Bedeutung. Defekte in diesen Gefäßen stellen schwere Gesundheitsrisiken dar, wie z. B. bei Arteriosklerose, die bei Patienten zu Herzinfarkten und Herzinsinnen führen kann. Folglich ist die koronare Herzkrankheit eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Trotz seiner klinischen Bedeutung wurden relativ wenig Fortschritte bei der Regenerierung beschädigter Herzkranzgefäße erzielt. Dennoch wurden in jüngster Zeit Fortschritte beim Verständnis des zellulären Ursprungs und der Differenzierungswege der Entwicklung von Koronaren erzielt. Das Aufkommen von Werkzeugen und Technologien, die es Forschern ermöglichen, Vorläuferzellen fluoreszierend zu kennzeichnen, ihrem Schicksal zu folgen und Progenies in vivo zu visualisieren, hat entscheidend dazu beigetragen, die Entwicklung des koronaren Gefäßes zu verstehen. In-vivo-Studien sind wertvoll, haben aber Einschränkungen in Bezug auf Geschwindigkeit, Zugänglichkeit und Flexibilität im experimentellen Design. Alternativ können genaue In-vitro-Modelle der koronaren Angiogenese diese Einschränkungen umgehen und es Forschern ermöglichen, wichtige biologische Fragen mit Schnelligkeit und Flexibilität zu hinterfragen. Das Fehlen geeigneter In-vitro-Modellsysteme könnte den Fortschritt beim Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen des koronaren Gefäßwachstums behindert haben. Hier beschreiben wir ein In-vitro-Kultursystem zum Anbau von Herzkranzgefäßen aus dem Sinus venosus (SV) und dem Endokard (Endo), den beiden Vorläufergeweben, aus denen viele der Herzkranzgefäße entstehen. Wir bestätigten auch, dass die Kulturen einige der bekannten In-vivo-Mechanismen genau rekapitulieren. Zum Beispiel zeigen wir, dass die angiogenen Sprossen in der Kultur von SV DEN COUP-TFII-Ausdruck ähnlich dem, was in vivo beobachtet wird, herunterregulieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass VEGF-A, ein bekannter angiogener Faktor in vivo, die Angiogenese sowohl aus der SV- als auch aus der Endo-Kultur robust stimuliert. Gemeinsam haben wir ein genaues In-vitro-Kulturmodell entwickelt, um die koronare Angiogenese zu untersuchen.
Introduction
Blutgefäße des Herzens werden gemeinhin als Herzkranzgefäße bezeichnet. Diese Gefäße bestehen aus Arterien, Venen und Kapillaren. Während der Entwicklung werden zunächst stark verzweigte Kapillaren etabliert, die sich dann in Herzkranzgefäße und Venen1,2,3,4,5umbauen. Diese anfänglichen Kapillaren werden aus endothelialen Vorläuferzellen im Proepikardien, Sinusvenosus (SV) und Endokardgewebe (Endo)1,6,7,8. SV ist das Zuflussorgan des embryonalen Herzens und Endo ist die innere Auskleidung des Herzlumens. Endotheliale Vorläuferzellen, die in der SV und Endo gefunden werden, bilden die Mehrheit der koronaren Vaskulatur, während das Proepikardie zu einem relativ kleinen Teildavon2 beiträgt. Der Prozess, durch den das Kapillarnetz der Herzkranzgefäße im Herzen aus seinen bereits existierenden Vorläuferzellen wächst, wird als koronare Angiogenese bezeichnet. Koronare Herzkrankheit ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit und dennoch fehlt eine wirksame Behandlung für diese Krankheit. Das Verständnis der detaillierten zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese kann bei der Entwicklung neuartiger und effektiver Therapien zur Reparatur und Regenerierung beschädigter Herzkranzgefäße nützlich sein.
In jüngster Zeit wurde durch die Entwicklung neuer Werkzeuge und Technologien ein Anstieg unseres Verständnisses für die Entwicklung von Herzkranzgefäßen erreicht. Insbesondere die In-vivo-Linienkennzeichnung und fortschrittliche Bildgebungstechnologien waren sehr nützlich bei der Aufdeckung des zellulären Ursprungs und der Differenzierungswege von Herzkranzgefäßen9,10,11,12. Trotz der Vorteile dieser In-vivo-Tools gibt es Einschränkungen in Bezug auf Geschwindigkeit, Flexibilität und Zugänglichkeit. Daher können robuste In-vitro-Modellsysteme In-vivo-Systeme ergänzen, um die zellulären und molekularen Mechanismen der koronaren Angiogenese in einer Art und Weise mit hohem Durchsatz aufzuklären.
Hier beschreiben wir ein In-vitro-Modell der koronaren Angiogenese. Wir haben ein In-vitro-Explantenkultursystem entwickelt, um Herzkranzgefäße aus zwei Vorläufergeweben, SV und Endo, anzubauen. Mit diesem Modell zeigen wir, dass die In-vitro-Gewebeexplantationskulturen koronare Gefäßsprossen wachsen, wenn sie durch Wachstumsmedium stimuliert werden. Zusätzlich wachsen die Explant-Kulturen schnell im Vergleich zur Kontrolle, wenn sie durch den vaskulären endotheliale Wachstumsfaktor A (VEGF-A), ein hochwirksames angiogenes Protein, stimuliert werden. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die angiogenen Sprossen aus der SV-Kultur venös dedifferenziert werden (Verlust der COUP-TFII-Expression), ein Mechanismus ähnlich der SV-Angiogenese in vivo1. Diese Daten deuten darauf hin, dass das In-vitro-Explantenkultursystem angiogene Ereignisse, die in vivo auftreten, originalgetreu wieder einführt. Zusammen genommen sind In-vitro-Modelle der Angiogenese, die hier beschrieben werden, ideal für die Untersuchung zellulärer und molekularer Mechanismen der koronaren Angiogenese in einer hohen Durchsatz- und zugänglichen Weise.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einige der wichtigsten Schritte für den erfolgreichen Anbau von Herzkranzgefäßen aus dem SV- und Endo-Vorläufergewebe sind: 1) Korrekte Identifizierung und Isolierung des SV-Gewebes für die SV-Kultur; 2) Verwendung von Ventrikeln aus Embryonen im Alter von e11-11,5 für eine genaue Endo-Kultur; 3) Aufrechterhaltung steriler Bedingungen während der gesamten Sezierzeit und halten das Gewebe zu jeder Zeit kalt; und 4) Beibehaltung der Anspannung der ECM-beschichteten Membran, um zu vermeiden, dass Gewebe im Medium sch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitgliedern des Sharma-Labors für die Bereitstellung einer unterstützenden Forschungsumgebung. Ein besonderer Dank gilt Diane (Dee) R. Hoffman, die unsere Mauskolonie pflegt und pflegt. Wir möchten auch Drs. Philip J. Smaldino und Carolyn Vann für das gründliche Korrekturlesen des Manuskripts und die Bereitstellung hilfreicher Kommentare danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel des Ball State University Provost Office und des Department of Biology an B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant Funds to B.S, nIH (RO1-HL128503) und The New York Stem Cell Foundation funds to K.R. unterstützt.
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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