관상 동맥 혈관 신생의 체외 모델
Summary
관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델은 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전의 발견을 위해 이용될 수 있다. 부비동 및 심내막 조직의 체외 배원 배양은 VEGF-A에 반응하여 견고한 성장을 나타내고 생체 내에서와 같이 COUP-TFII 발현의 유사한 패턴을 표시한다.
Abstract
여기서, 우리는 관상 동맥 혈관신생을 연구하기 위한 시험관 내 배양 분석방법을 기술한다. 관상 동맥 혈관은 심장 근육을 공급하고 임상적으로 중요합니다. 이 혈관에 있는 결점은 환자에 있는 심근 경색 그리고 심부전으로 이끌어 낼 수 있는 동맥 경화증과 같은 가혹한 건강 리스크를 나타냅니다. 따라서 관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 그것의 임상 중요성에도 불구 하 고, 상대적으로 작은 진전 손상 된 관상 동맥을 재생 하는 방법에 만들어졌다. 그럼에도 불구하고, 최근 관상동맥 혈관 발달의 세포 기원 및 분화 경로를 이해하는 데 진전이 이루어지고 있다. 연구원이 형광성으로 선조 세포에 라벨을 붙이고, 그들의 운명을 따르고, 생체 내에서 자손을 시각화 할 수있는 도구와 기술의 출현은 관상 동맥 혈관 발달을 이해하는 데 중요한 역할을했습니다. 생체 내 연구는 가치가 있지만 실험 설계의 속도, 접근성 및 유연성 측면에서 한계가 있습니다. 양자택일로, 관상 동맥 혈관 신생의 정확한 시험관 내 모형은 이 한계를 우회하고 연구원이 속도와 융통성 있는 중요한 생물학 질문을 심문하는 것을 허용할 수 있습니다. 적절한 시험관 내 모델 시스템의 부족은 관상 동맥 혈관 성장의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 진행을 방해 할 수있다. 여기서, 우리는 많은 관상 동맥이 발생하는 부비동(SV) 및 심내막(Endo)으로부터 관상동맥 혈관을 성장시키는 체외 배양 시스템을 설명한다. 우리는 또한 문화가 정확하게 생체 내 메커니즘의 일부를 재현 것을 확인했다. 예를 들어, 우리는 SV다운조절 COUP-TFII 발현으로부터의 배양물에서 혈관신생 콩싹이 생체내에서 관찰되는 것과 유사하다는 것을 보여준다. 또한 생체 내에서 잘 알려진 혈관 신생 인자 인 VEGF-A가 SV 및 엔도 문화 모두에서 혈관 신생을 강력하게 자극한다는 것을 보여줍니다. 종합적으로, 우리는 관상 동맥 혈관 신생을 공부하기 위하여 시험관 내 배양 모형을 고안했습니다.
Introduction
심혼의 혈관은 일반적으로 관상 동맥 혈관에게 불립니다. 이 혈관은 동맥, 정맥 및 모세 혈관으로 구성됩니다. 개발 하는 동안, 높은 분기 모 세 혈관 먼저 설립, 관상 동맥과 정 맥으로 리모델링1,2,3,4,5. 이들 초기 모세혈관은 내피카슘, 부비동(SV) 및 내막부(Endo) 조직1,6,7,8에서발견되는 내피전구 세포로부터 구축된다. SV는 배아 심장의 유입 기관이며 엔도는 심장 루멘의 내벽입니다. SV 및 엔도에서 발견되는 내피 전구 세포는 관상 동맥 혈관구조의 대부분을 구축하는 반면, 프로피카슘은 그것의 상대적으로 작은 부분에기여한다 2. 관상 동맥 혈관의 모세관 네트워크가 기존의 전구체 세포에서 심장에서 성장하는 과정을 관상 동맥 혈관 신생이라고합니다. 관상 동맥 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이며이 질병에 대한 효과적인 치료법이 부족합니다. 관상 동맥 혈관 신생의 상세한 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 손상된 관상 동맥을 복구하고 재생하는 새롭고 효과적인 치료법을 설계하는 데 유용 할 수 있습니다.
최근에는 관상 동맥 선박이 어떻게 개발되는지에 대한 이해가 급증하면서 새로운 도구와 기술의 개발을 통해 부분적으로 달성되었습니다. 특히, 생체내 계보 라벨링 및 첨단 영상 기술은 관상동맥 혈관의 세포 기원 및 분화 경로를 밝히는 데 매우 유용하여9,10,11,12. 이러한 생체 내 도구의 장점에도 불구하고 속도, 유연성 및 접근성 측면에서 는 한계가 있습니다. 따라서, 견고한 시험관 내 모델 시스템은 생체 내 시스템을 보완하여 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 메커니즘을 높은 처리량 방식으로 해명할 수 있다.
여기서, 우리는 관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델을 기술한다. 우리는 두 개의 전구 조직, SV 및 엔도에서 관상 동맥 혈관을 성장하는 시험관 내 배양 시스템을 개발했습니다. 이 모델을 통해, 우리는 시험관 내 조직 배양 배양이 성장 배지에 의해 자극될 때 관상 동맥 혈관 새싹을 성장한다는 것을 보여준다. 추가적으로, 배양 배양은 혈관 내피 성장 인자 A(VEGF-A)에 의해 자극될 때 대조군과 비교하여 급속히 성장하며, 매우 강력한 혈관신생 단백질이다. 더욱이, 우리는 SV 배양으로부터의 혈관신생 싹이 생체내SV 혈관신생과 유사한 기전인 정맥탈분화(COUP-TFII 발현의 손실)를 겪는다는 것을 발견하. 이러한 데이터는 시험관 내 배원 배양 시스템이 생체 내에서 발생하는 혈관신생 사건을 충실하게 회복한다는 것을 시사한다. 집합적으로, 여기에 기술되는 혈관신생의 시험관내 모델은 높은 처리량 및 접근 가능한 방식으로 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전을 조사하는 데 이상적입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
SV 및 엔도 전구 조직으로부터 관상 동맥 혈관을 성공적으로 성장시키는 가장 중요한 단계 중 일부는 다음과 같습니다: 1) SV 배양을 위한 SV 조직을 올바르게 식별하고 격리하는 단계; 2) 정확한 엔도 배양을 위해 e11-11.5의 나이 사이의 배아로부터의 심실을 사용하는 단계; 3) 해부 기간 내내 멸균 상태를 유지하고 조직을 항상 차갑게 유지; 및 4) 배지에 부동하는 조직을 피하기 위해 ECM 코팅 막에 부?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 지원 연구 환경을 제공 샤르마 연구소의 구성원에게 감사드립니다. 우리는 우리의 마우스 식민지를 유지하고 돌보는 다이앤 (디) R. 호프만에게 특별한 감사를 전하고 싶습니다. 우리는 또한 철저하게 원고를 교정하고 유용한 의견을 제공 필립 J. 스말디노 박사와 캐롤린 반 감사드립니다. 이 작품은 볼 스테이트 대학 프로보스트 사무실과 생물학학과에서 B.S에, 과학 수석 연구 보조금 기금 B.S에 인디애나 아카데미, NIH (RO1-HL128503) 및 뉴욕 줄기 세포 재단 기금K.R.
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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