Modèle in Vitro de l’angiogenèse coronaire

Summary

Des modèles in vitro d’angiogenèse coronaire peuvent être utilisés pour la découverte des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire. Les cultures d’explantation in vitro des tissus sinus venosus et endocardium montrent une croissance robuste en réponse au VEGF-A et affichent un modèle similaire d’expression DEMENT-TFII comme in vivo.

Abstract

Ici, nous décrivons un essai in vitro de culture pour étudier l’angiogenèse coronaire. Les vaisseaux coronaires nourrissent le muscle cardiaque et sont d’importance clinique. Les défauts dans ces vaisseaux représentent des risques graves pour la santé tels que dans l’athérosclérose, qui peut mener aux infarctus du myocarde et aux insuffisances cardiaques chez les patients. Par conséquent, la maladie coronarienne est l’une des principales causes de décès dans le monde. En dépit de son importance clinique, relativement peu de progrès ont été réalisés sur la façon de régénérer les artères coronaires endommagées. Néanmoins, des progrès récents ont été réalisés dans la compréhension de l’origine cellulaire et des voies de différenciation du développement des vaisseaux coronaires. L’avènement d’outils et de technologies qui permettent aux chercheurs d’étiqueter fluorescentement les cellules progénitrices, de suivre leur destin et de visualiser les descendants in vivo ont joué un rôle déterminant dans la compréhension du développement des vaisseaux coronaires. Les études in vivo sont précieuses, mais ont des limites en termes de vitesse, d’accessibilité et de flexibilité dans la conception expérimentale. Alternativement, des modèles in vitro précis de l’angiogenèse coronaire peuvent contourner ces limitations et permettre aux chercheurs d’interroger d’importantes questions biologiques avec rapidité et flexibilité. L’absence de systèmes modèles in vitro appropriés peut avoir entravé les progrès dans la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance des vaisseaux coronaires. Ici, nous décrivons un système de culture in vitro pour cultiver des vaisseaux coronaires du sinus venosus (SV) et de l’endocardium (Endo), les deux tissus progéniteurs à partir desquels de nombreux vaisseaux coronaires surgissent. Nous avons également confirmé que les cultures récapitulent avec précision certains des mécanismes in vivo connus. Par exemple, nous montrons que les germes angiogéniques dans la culture de SV déréglementent l’expression COUP-TFII semblable à ce qui est observé in vivo. En outre, nous montrons que VEGF-A, un facteur angiogénique bien connu in vivo, stimule vigoureusement l’angiogenèse des cultures SV et Endo. Collectivement, nous avons conçu un modèle précis de culture in vitro pour étudier l’angiogenèse coronaire.

Introduction

Les vaisseaux sanguins du cœur sont communément appelés vaisseaux coronaires. Ces vaisseaux sont composés d’artères, de veines et de capillaires. Pendant le développement, des capillaires fortement ramifiés sont établis d’abord, qui se transforment ensuite en artères coronaires et veines^1,2,3,4,5. Ces capillaires initiaux sont construits à partir de cellules progénitrices endothéliales trouvées dans le proépicardium, sinus venosus (SV), et endocardium (Endo) tissus^1,6,7,8. SV est l’organe d’afflux de cœur embryonnaire et Endo est la doublure intérieure du lumen de coeur. Les cellules progénitrices endothéliales trouvées dans le SV et l’Endo construisent la majorité de la vascularisation coronaire, tandis que le proépicardium contribue à une partie relativement faible de^{celui-ci 2}. Le processus par lequel le réseau capillaire des vaisseaux coronaires se développe dans le cœur à partir de ses cellules précurseurs préexistantes est appelé angiogenèse coronaire. La maladie coronarienne est l’une des principales causes de décès dans le monde et pourtant un traitement efficace pour cette maladie fait défaut. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires détaillés de l’angiogenèse coronaire peut être utile dans la conception de thérapies nouvelles et efficaces pour réparer et régénérer les artères coronaires endommagées.

Récemment, une augmentation de notre compréhension de la façon dont les vaisseaux coronariens se développent a été en partie réalisée grâce au développement de nouveaux outils et technologies. En particulier, l’étiquetage in vivo de lignée et les technologies d’imagerie de pointe ont été très utiles pour découvrir l’origine cellulaire et les voies de différenciation des vaisseaux coronaires^9,10,11,12. Malgré les avantages de ces outils in vivo, il y a des limites en termes de rapidité, de flexibilité et d’accessibilité. Par conséquent, des systèmes modèles in vitro robustes peuvent compléter les systèmes in vivo pour élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire d’une manière à haut débit.

Ici, nous décrivons un modèle in vitro de l’angiogenèse coronaire. Nous avons développé un système de culture d’explation in vitro pour cultiver des vaisseaux coronaires à partir de deux tissus progéniteurs, SV et Endo. Avec ce modèle, nous montrons que les cultures d’explants de tissu in vitro cultivent des germes de vaisseau coronaires lorsqu’elles sont stimulées par le milieu de croissance. En outre, les cultures explantées se développent rapidement par rapport au contrôle lorsqu’elles sont stimulées par le facteur de croissance endothélial vasculaire A (VEGF-A), une protéine angiogénique très puissante. En outre, nous avons constaté que les germes angiogéniques de la culture SV subissent la dénodéliation veineuse (perte de l’expression COUP-TFII), un mécanisme similaire à l’angiogenèse SV in vivo¹. Ces données suggèrent que le système de culture explantée in vitro rétablisse fidèlement les événements angiogéniques qui se produisent in vivo. Collectivement, les modèles in vitro de l’angiogenèse qui sont décrits ici sont idéaux pour sonder les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’angiogenèse coronaire d’une manière élevée et accessible.

Protocol

L’utilisation de tous les animaux dans ce protocole a suivi les lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels de l’Université d’État de Ball State (IACUC). 1. Établir des éleveurs de souris et détecter les prises vaginales pour les grossesses chronométrées Installez une cage de reproduction de souris avec des souris mâles et femelles de type sauvage. Assurez-vous que l’âge des souris reproductrices est compris entre 6 et 8 sema…

Representative Results

Une des caractéristiques les plus frappantes de l’angiogenèse SV in vivo est qu’il suit une voie spécifique et implique la dénduisation cellulaire et les événements de redifferentiation qui se produisent à des moments stéréotypés et les positions1. Au fur et à mesure que les cellules SV initiales se développent sur le ventricule cardiaque, elles cessent de produire des marqueurs veineux tels que LE COUP-TFII(figure 7). …

Discussion

Quelques-unes des étapes les plus critiques pour la croissance réussie des vaisseaux coronaires des tissus progéniteurs SV et Endo sont : 1) Identifier correctement et isoler le tissu SV pour la culture SV ; 2) en utilisant des ventricules d’embryons âgés de 11 à 11,5 ans pour une culture précise d’Endo; 3) maintenir des conditions stériles tout au long de la période de dissection et garder les tissus froids en tout temps; et 4) garder les explants attachés à la membrane enduite ECM pour éviter que les ti…

Materials

100 x 20 MM Tissue Culture Dish	Fisher Scientific	877222	Referred in the protocol as Petri dish
24-well plates	Fisher Scientific	08-772-51
8.0 uM PET membrane culture inserts	Millipore Sigma	MCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555	Fisher Scientific	A31572	Secondary antibody
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488	Fisher Scientific	A21206	Secondary antibody
Angled Metal Probe	Fine science tools	10088-15	Angled 45 degree, used for detecting deep plugs
Anti- ERG 1/2/3 antibody	Abcam	Ab92513	Primary antibody
Anti- VE-Cadherin antibody	Fisher Scientific	BDB550548	Primary antibody, manufacturer BD BioSciences
CO2 gas tank	Various suppliers	N/A
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13998223	For 37 °C, 5% CO2 incubation
Dissection stereomicrosope	Leica	S9i	Leica S9i Stereomicroscope
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156	Endothelial cell growth basal media
ECM solution	Corning	354230	Commercially known as Matrigel
EGM-2 MV Singlequots Kit	Lonza	CC-4147	Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007003IR
FiJi	NIH	NA	Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine Forceps	Fine science tools	11412-11	Used for embryo dissection
Fisherbrand Straight-Blade operating scissors	Fisher Scientific	13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	SH-302-5601LR
Laminar flow tissue culture hood	Fisher Scientific	various models available
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1200	Vectashield with DAPI
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy/Fisher	50-980-494	This is available at 32%; needs to be diluted to 4%
Perforated spoon	Fine science tools	10370-18	Useful in removing embryo/tissues from a solution
Recombinant Murine VEGF-A 165	PeproTech	450-32
Standard forceps, Dumont #5	Fine science tools	11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamber	Easysysteminc	EZ-1785	Euthanasia chamber