Summary
Modelos in vitro de angiogênese coronariana podem ser utilizados para a descoberta dos mecanismos celulares e moleculares da angiogênese coronariana. Culturas in vitro explantam tecidos sinus venosos e endocárdios mostram crescimento robusto em resposta ao VEGF-A e apresentam um padrão semelhante de expressão COUP-TFII como in vivo.
Abstract
Aqui, descrevemos um ensaio de cultura in vitro para estudar angiogênese coronariana. Vasos coronários alimentam o músculo cardíaco e são de importância clínica. Defeitos nesses vasos representam graves riscos à saúde, como na aterosclerose, que podem levar a infartos do miocárdio e insuficiências cardíacas em pacientes. Consequentemente, a doença arterial coronariana é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Apesar de sua importância clínica, relativamente pouco progresso foi feito sobre como regenerar artérias coronárias danificadas. No entanto, avanços recentes foram feitos na compreensão da origem celular e das vias de diferenciação do desenvolvimento de vasos coronários. O advento de ferramentas e tecnologias que permitem aos pesquisadores rotular fluorescentemente células progenitoras, seguir seu destino e visualizar progêias in vivo têm sido fundamentais na compreensão do desenvolvimento de vasos coronários. Estudos in vivo são valiosos, mas têm limitações em termos de velocidade, acessibilidade e flexibilidade no design experimental. Alternativamente, modelos in vitro precisos de angiogênese coronariana podem contornar essas limitações e permitir que os pesquisadores interroguem questões biológicas importantes com rapidez e flexibilidade. A falta de sistemas de modelo in vitro adequados pode ter dificultado o progresso na compreensão dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento de vasos coronários. Aqui, descrevemos um sistema de cultura in vitro para cultivar vasos coronários a partir do sinus venosus (SV) e endocárdio (Endo), os dois tecidos progenitores dos quais muitos dos vasos coronários surgem. Também confirmamos que as culturas recapitulam com precisão alguns dos mecanismos in vivo conhecidos. Por exemplo, mostramos que os brotos angiogênicos na cultura a partir de SV para baixo regulam a expressão COUP-TFII semelhante ao observado in vivo. Além disso, mostramos que o VEGF-A, um conhecido fator angiogênico in vivo, estimula robustamente a angiogênese das culturas SV e Endo. Coletivamente, criamos um modelo preciso de cultura in vitro para estudar angiogênese coronariana.
Introduction
Vasos sanguíneos do coração são comumente chamados vasos coronários. Esses vasos são compostos por artérias, veias e capilares. Durante o desenvolvimento, primeiro são estabelecidos capilares altamente ramificados, que depois se remodelam em artérias coronárias e veias1,2,3,4,5. Estes capilares iniciais são construídos a partir de células progenitoras endoteliais encontradas nos tecidos proepicárdio, sinus venoso (SV) e endocárdio (Endo)1,6,7,8. SV é o órgão de entrada do coração embrionário e Endo é o revestimento interno do lúmen do coração. As células progenitoras endoteliais encontradas no SV e no Endo constroem a maioria da vasculatura coronária, enquanto o proepicárdio contribui para uma porção relativamente pequena dela2. O processo pelo qual a rede capilar de vasos coronários cresce no coração a partir de suas células precursoras pré-existentes é chamado angiogênese coronariana. A doença arterial coronariana é uma das principais causas de morte em todo o mundo e ainda falta um tratamento eficaz para esta doença. Compreender os mecanismos celulares e moleculares detalhados da angiogênese coronariana pode ser útil na concepção de terapias novas e eficazes para reparar e regenerar artérias coronárias danificadas.
Recentemente, uma onda de compreensão de como os vasos coronários se desenvolvem tem sido, em parte, alcançada através do desenvolvimento de novas ferramentas e tecnologias. Em particular, a rotulagem de linhagem in vivo e tecnologias avançadas de imagem têm sido muito úteis para descobrir a origem celular e as vias de diferenciação dos vasos coronários9,10,11,12. Apesar das vantagens dessas ferramentas in vivo, há limitações em termos de velocidade, flexibilidade e acessibilidade. Portanto, sistemas robustos de modeloin vitro podem complementar sistemas in vivo para elucidar os mecanismos celulares e moleculares da angiogênese coronariana de forma de alta duração.
Aqui, descrevemos um modelo in vitro de angiogênese coronariana. Desenvolvemos um sistema de cultura de explante in vitro para cultivar vasos coronários a partir de dois tecidos progenitores, SV e Endo. Com este modelo, mostramos que as culturas de tecido in vitro explantam brotam de vasos coronários quando estimuladas pelo meio de crescimento. Além disso, as culturas explantes crescem rapidamente em comparação com o controle quando estimuladas pelo fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A), uma proteína angiogênica altamente potente. Além disso, verificou-se que os brotos angiogênicos da cultura SV sofrem desdiferenciação venosa (perda da expressão COUP-TFII), mecanismo semelhante à angiogênese SV in vivo1. Esses dados sugerem que o sistema de cultura in vitro explanta fielmente restabelece eventos angiogênicos que ocorrem in vivo. Coletivamente, modelos in vitro de angiogênese descritos aqui são ideais para sondar mecanismos celulares e moleculares de angiogênese coronariana de forma de alto nível e acessível.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algumas das etapas mais críticas para o crescimento com sucesso de vasos coronários dos tecidos progenitores SV e Endo são: 1) Identificar e isolar corretamente o tecido SV para a cultura SV; 2) utilizar ventrículos de embriões entre as idades de e11-11,5 para cultura endo precisa; 3) manter as condições estéreis durante todo o período de dissecção e manter os tecidos frios o tempo todo; e 4) manter as explantas presas à membrana revestida de ECM para evitar que o tecido flutuasse no meio.
<p class="jove_…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem aos membros do laboratório Sharma por fornecer um ambiente de pesquisa de apoio. Gostamos de agradecer especialmente a Diane (Dee) R. Hoffman que mantém e cuida da nossa colônia de ratos. Também gostaríamos de agradecer aos Drs. Philip J. Smaldino e Carolyn Vann por revisarem completamente o manuscrito e fornecerem comentários úteis. Este trabalho foi apoiado por fundos do Ball State University Provost Office and Department of Biology to B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant funds to B.S, e NIH (RO1-HL128503) e the New York Stem Cell Foundation fundos para K.R.
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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