Koroner Anjiyogenezin In Vitro Modeli
Summary
Koroner anjiyogenezin in vitro modelleri koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarının keşfinde kullanılabilir. Sinüs venöz ve endkard dokularının in vitro eksplant kültürleri VEGF-A’ya yanıt olarak sağlam bir büyüme gösterir ve in vivo olarak coup-TFII ekspresyonunun benzer bir modelini gösterir.
Abstract
Burada, koroner anjiyogenezi incelemek için in vitro kültür analizini tanımlıyoruz. Koroner damarlar kalp kasını besler ve klinik öneme sahiptir. Bu damarlarda kusurları ateroskleroz gibi ciddi sağlık riskleri temsil, hangi hastalarda miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliğine yol açabilir. Sonuç olarak, koroner arter hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Klinik önemine rağmen, hasarlı koroner arterlerin nasıl yenilenecekkonusunda nispeten az ilerleme kaydedilmiştir. Bununla birlikte, koroner damar gelişiminin hücresel kökeni ve farklılaşma yollarının anlaşılmasında son zamanlarda ilerleme kaydedilmiştir. Araştırmacıların flüoresanslı ata hücrelerini etiketlemelerine, kaderlerini takip etmelerine ve in vivo’da ataları görselleştirmelerine olanak tanıyan araç ve teknolojilerin ortaya çıkışı, koroner damar gelişimini anlamada etkili olmuştur. In vivo çalışmalar değerlidir, ancak deneysel tasarımda hız, erişilebilirlik ve esneklik açısından sınırlamalar vardır. Alternatif olarak, koroner anjiyogenezin in vitro modelleri bu sınırlamaları aşabilir ve araştırmacıların önemli biyolojik soruları hız ve esneklikle sorgulamalarına olanak sağlar. Uygun in vitro model sistemlerinin eksikliği koroner damar büyümesinin hücresel ve moleküler mekanizmalarının anlaşılmasında ilerlemeyi engellemiş olabilir. Burada, sinüs venöz (SV) ve endokardyum (Endo), koroner damarların çoğu ortaya çıkan iki ata dokularından koroner damarlar büyümek için bir in vitro kültür sistemi açıklar. Ayrıca kültürlerin bilinen in vivo mekanizmaların bazılarını doğru bir şekilde özetlediğini de doğruladık. Örneğin, SV’den gelen kültürdeki anjiyojenik filizlerin in vivo gözlenene benzer COUP-TFII ifadesini etkisiz kizlediğini gösteriyoruz. Buna ek olarak, vivo’da iyi bilinen bir anjiyojenik faktör olan VEGF-A’nın hem SV hem de Endo kültürlerinden anjiyogenezi sağlam bir şekilde uyardığını gösteriyoruz. Koroner anjiyogenezi incelemek için topluca doğru bir in vitro kültür modeli tasarladık.
Introduction
Kalbin kan damarları genellikle koroner damarlar denir. Bu damarlar arterler oluşur, damarlar, ve kılcal damarlar. Geliştirme sırasında, yüksek dallı kılcal damarlar ilk kurulur, daha sonra koroner arterler ve damarlar içine remodel1,2,3,4,5. Bu ilk kılcal damarlar proepicardium bulunan endotel progenitor hücreleri inşa edilmiştir, sinüs venöz (SV), ve endokardiyum (Endo) dokular1,6,7,8. SV embriyonik kalbin giriş organı dır ve Endo kalp lümen iç astar olduğunu. SV ve Endo bulunan endotel progenitor hücreleri koroner vaskülatür çoğunluğu oluşturmak, proepikardiyum bunun nispeten küçük bir kısmına katkıda ise2. Koroner damarların kılcal ağ önceden varolan öncü hücrelerinden kalpte büyümek hangi süreci koroner anjiyogenez denir. Koroner arter hastalığı dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir ve henüz bu hastalık için etkili bir tedavi eksiktir. Koroner anjiyogenezin ayrıntılı hücresel ve moleküler mekanizmalarını anlamak, hasarlı koroner arterleri onarmak ve yenilemek için yeni ve etkili tedavilerin tasarımında yararlı olabilir.
Son zamanlarda, koroner damarların nasıl geliştiğine olan anlayışımızda bir dalgalanma kısmen yeni araçlar ve teknolojilerin geliştirilmesi ile sağlanmıştır. Özellikle, in vivo soy etiketleme ve gelişmiş görüntüleme teknolojileri koroner damarların hücresel kökenli ve farklılaşma yollarını ortaya çıkarmak için çok yararlı olmuştur9,10,11,12. Bu in vivo araçlarının avantajlarına rağmen, hız, esneklik ve erişilebilirlik açısından sınırlamalar vardır. Bu nedenle, sağlam in vitro model sistemleri yüksek iş lenme li bir şekilde koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarını açıklığa kavuşturmak için in vivo sistemleri tamamlayabilir.
Burada koroner anjiyogenezin in vitro modelini tanımlıyoruz. Biz iki ata dokuları, SV ve Endo koroner damarlar büyümek için bir in vitro ekplant kültür sistemi geliştirdik. Bu model ile, in vitro doku eksplant kültürleri büyüme ortamı tarafından uyarıldığında koroner damar filizi büyümek olduğunu göstermektedir. Ayrıca, eksplant kültürleri vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGF-A), son derece güçlü bir anjiyojenik protein tarafından uyarıldığında kontrol ile karşılaştırıldığında hızla büyür. Ayrıca, SV kültüründen anjiyojenik filizlerin venöz defarkyasyona (COUP-TFII ekspresyonu kaybı), vivo1’dekiSV anjiyogenezine benzer bir mekanizmaya maruz kaldığımız saptandı. Bu veriler, in vitro explant kültür sisteminin in vivo’da meydana gelen anjiyojenik olayları sadakatle yeniden ortaya attığını göstermektedir. Burada açıklanan anjiyogenezin in vitro modelleri, koroner anjiyogenezin hücresel ve moleküler mekanizmalarını yüksek iş ve erişilebilir bir şekilde araştırmak için idealdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
SV ve Endo ata dokularından başarılı bir şekilde büyüyen koroner damarlar için en kritik adımlardan bazıları şunlardır: 1) SV kültürü için SV dokusunun doğru tanımlanması ve izole edilmesi; 2) doğru Endo kültürü için e11−11.5 yaşları arasında embriyolardan ventriküller kullanarak; 3) diseksiyon süresi boyunca steril koşulları korumak ve dokuları her zaman soğuk tutmak; ve 4) ortamda yüzen doku önlemek için ECM kaplı membran bağlı eksplants tutmak.
İlk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar destekleyici bir araştırma ortamı sağlamak için Sharma laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Fare kolonimizi koruyan ve önemseyen Diane (Dee) R. Hoffman’a özel teşekkürlerimizi sunmayı seviyoruz. Ayrıca Dr. Philip J. Smaldino ve Carolyn Vann’a el yazmasının iyice kanıtlanması ve yararlı yorumlar da sunulması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ball State Üniversitesi Provost Office ve Biyoloji Bölümü B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fonları B.S ve NIH (RO1-HL128503) ve New York Kök Hücre Vakfı fonlarından K.R.’ye kadar desteklenmiştir.
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
