في المختبر نموذج الأوعية التاجية
Summary
في المختبر يمكن استخدام نماذج تولد الأوعية التاجية لاكتشاف الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية. في المختبر الثقافات الاستئصالية من الأنسجة الودينة والشغاف تظهر نموا قويا استجابة لVEGF-A وعرض نمط مماثل من التعبير COUP-TFII كما هو الحال في الجسم الحي.
Abstract
هنا، نصف في المختبر الثقافة الزرع لدراسة الأوعية التاجية. الأوعية التاجية تغذية عضلة القلب وذات أهمية سريرية. العيوب في هذه الأوعية تمثل مخاطر صحية شديدة مثل تصلب الشرايين، والتي يمكن أن تؤدي إلى احتشاء عضلة القلب وفشل القلب في المرضى. وبالتالي، فإن مرض الشريان التاجي هو أحد الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من أهميتها السريرية، لم يتم إحراز تقدم يذكر نسبيا في كيفية تجديد الشرايين التاجية التالفة. ومع ذلك، فقد أُحرز تقدم في الآونة الأخيرة في فهم المنشأ الخلوي ومسارات التمايز لتطوير الأوعية التاجية. وكان ظهور الأدوات والتكنولوجيات التي تسمح للباحثين لتسمية خلايا السلف الفلورسنت، ومتابعة مصيرها، وتصور progenies في الجسم الحي، تلعب دورا ً أساسياً في فهم تطور الأوعية التاجية. في دراسات الجسم الحي قيمة، ولكن لها قيود من حيث السرعة، وسهولة الوصول، والمرونة في التصميم التجريبي. بدلا من ذلك، يمكن للنماذج الدقيقة في المختبر لتولد الأوعية التاجية التحايل على هذه القيود والسماح للباحثين لاستجواب الأسئلة البيولوجية الهامة بسرعة ومرونة. قد يكون عدم وجود أنظمة نموذج في المختبر المناسب قد أعاق التقدم في فهم الآليات الخلوية والجزيئية لنمو الأوعية التاجية. هنا ، نصف نظام الاستزراع في المختبر لزراعة الأوعية التاجية من الوريد الالجيوب الأنفية (SV) وendocardium (Endo)، وهما أنسجة السلف التي تنشأ منها العديد من الأوعية التاجية. كما أكدنا أن الثقافات تُلخص بدقة بعض الآليات المعروفة في الجسم الحي. على سبيل المثال، نحن نظهر أن براعم الأوعية في الثقافة من SV downregulate COUP-TFII التعبير مماثلة لما لوحظ في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن VEGF-A ، وهو عامل أنجيوجينيك معروف في الجسم الحي ، يحفز بقوة تولد الأوعية من كل من ثقافات SV و Endo. بشكل جماعي ، ابتكرنا نموذجًا دقيقًا في الثقافة المختبرية لدراسة تولد الأوعية التاجية.
Introduction
تسمى الأوعية الدموية للقلب عادة الأوعية التاجية. تتكون هذه الأوعية من الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية. أثناء التطوير ، يتم إنشاء الشعيرات الدموية المتفرعة للغاية أولاً ، والتي تعيد تشكيلها بعد ذلك في الشرايين التاجية والأوردة1،2،3،4،5. يتم بناء هذه الشعيرات الدموية الأولية من الخلايا السلف البوالجينية الموجودة في proepicardium ، ووينوس الجيوب الأنفية (SV) ، وأنسجة الشغاف (Endo)1،6،7،8. SV هو عضو تدفق القلب الجنينية وإندو هو البطانة الداخلية للتجويف القلب. الخلايا السلف الاندوري وجدت في SV وEndo بناء غالبية الأوعية الدموية التاجية، في حين أن proepicardium يساهم في جزء صغير نسبيا منه2. وتسمى العملية التي تنمو بها الشبكة الشعرية للأوعية التاجية في القلب من خلاياها السليفة الموجودة مسبقًا تولد الأوعية التاجية. مرض الشريان التاجي هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم وحتى الآن لا يوجد علاج فعال لهذا المرض. يمكن أن يكون فهم الآليات الخلوية والجزيئية التفصيلية لتكوين الأوعية التاجية مفيدًا في تصميم علاجات جديدة وفعالة لإصلاح الشرايين التاجية التالفة وتجديدها.
في الآونة الأخيرة، تم تحقيق طفرة في فهمنا لكيفية تطور الأوعية التاجية جزئيا من خلال تطوير أدوات وتقنيات جديدة. على وجه الخصوص ، في تسمية النسب الحي وتقنيات التصوير المتقدمة كانت مفيدة للغاية في الكشف عن المنشأ الخلوي ومسارات التمايز للأوعية التاجية9،10،11،12. على الرغم من مزايا هذه في أدوات الجسم الحي ، هناك قيود من حيث السرعة والمرونة وسهولة الوصول. لذلك ، يمكن أن تكمل أنظمة النموذج المختبري القوية في أنظمة الجسم الحي لتوضيح الآليات الخلوية والجزيئية لتكوين الأوعية التاجية بطريقة عالية الإنتاجية.
هنا، نصف نموذج في المختبر من تولد الأوعية التاجية. لقد قمنا بتطوير نظام زراعة الاستئصال في المختبر لزراعة الأوعية التاجية من اثنين من أنسجة السلف، SV وEndo. مع هذا النموذج، ونحن نظهر أن الثقافات في الأنسجة المختبرية explant تنمو براعم الأوعية التاجية عندما حفزت من قبل متوسط النمو. بالإضافة إلى ذلك، تنمو الثقافات النباتية بسرعة مقارنة بالتحكم عندما يحفزها عامل النمو البائي A (VEGF-A)، وهو بروتين أنجيوجينيك قوي للغاية. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن براعم الأوعية من ثقافة SV الخضوع إزالة التمايز وينوب (فقدان التعبير COUP-TFII)، وهي آلية مماثلة لتولد الأوعية SV في الجسم الحي1. هذه البيانات تشير إلى أن نظام الثقافة في المختبر explant يعيد بأمانة الأحداث الوعائية التي تحدث في الجسم الحي. بشكل جماعي ، في نماذج المختبر من تولد الأوعية التي يتم وصفها هنا مثالية للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية لتولد الأوعية التاجية بطريقة عالية الإنتاجية ويمكن الوصول إليها.
Protocol
Representative Results
Discussion
بعض الخطوات الأكثر أهمية لزراعة الأوعية التاجية بنجاح من أنسجة السلف SV وEndo هي: 1) تحديد وعزل أنسجة SV بشكل صحيح لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحديد وعزل أنسجة SV لاستزراع SV؛ 1) تحدي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون أعضاء مختبر شارما على توفير بيئة بحثية داعمة. نود أن نقدم لكم شكرا خاصا لديان (دي) R. هوفمان الذي يحافظ ويهتم لدينا مستعمرة الماوس. كما نود أن نشكر الدكتورين فيليب ج. سمالدينو وكارولين فان على تدقيق المخطوطة بدقة وتقديم تعليقات مفيدة. تم دعم هذا العمل من خلال أموال من مكتب عميد جامعة ولاية بول وقسم البيولوجيا إلى بكالوريوس، وأكاديمية إنديانا للعلوم صناديق منحة البحوث العليا إلى B.S، والمعاهد القومية للصحة (RO1-HL128503) ومؤسسة الخلايا الجذعية في نيويورك أموال إلى K.R.
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
- Red-Horse, K., et al. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).
- Chen, H. I., et al. The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis. Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).
- Volz, K. S., et al. Pericytes are progenitors for coronary artery smooth muscle. Elife. 4, (2015).
- Chen, H. I., et al. VEGF-C and aortic cardiomyocytes guide coronary artery stem development. Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4899-4914 (2014).
- Chang, A. H., et al. DACH1 stimulates shear stress-guided endothelial cell migration and coronary artery growth through the CXCL12-CXCR4 signaling axis. Genes and Development. , (2017).
- Tian, X., et al. Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries. Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).
- Wu, B., et al. Endocardial Cells Form the Coronary Arteries by Angiogenesis through Myocardial-Endocardial VEGF Signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Developmental Cell. 22 (3), 639-650 (2012).
- Das, S., Red-Horse, K. Cellular plasticity in cardiovascular development and disease. Developmental Dynamics. 246 (4), 328-335 (2017).
- Sharma, B., Chang, A., Red-Horse, K. Coronary Artery Development: Progenitor Cells and Differentiation Pathways. Annual Review of Physiology. 79, 1-19 (2017).
- Tian, X., Pu, W. T., Zhou, B. Cellular origin and developmental program of coronary angiogenesis. Circulation Research. 116 (3), 515-530 (2015).
- Wu, B., et al. Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling. Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).
- Gerhardt, H., et al. VEGF guides angiogenic sprouting utilizing endothelial tip cell filopodia. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1163-1177 (2003).
- Ruhrberg, C., et al. Spatially restricted patterning cues provided by heparin-binding VEGF-A control blood vessel branching morphogenesis. Genes and Development. 16 (20), 2684-2698 (2002).
- Kikuchi, R., et al. An antiangiogenic isoform of VEGF-A contributes to impaired vascularization in peripheral artery disease. Nature Medicine. 20 (12), 1464-1471 (2002).
- Folkman, J., et al. Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. Journal of Experimental Medicine. 133 (2), 275-288 (1971).
- Ferrara, N. The role of VEGF in the regulation of physiological and pathological angiogenesis. Experientia Supplementum. (94), 209-231 (2005).
- Ferrara, N., Bunting, S. Vascular endothelial growth factor, a specific regulator of angiogenesis. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 5 (1), 35-44 (1996).
- Sharma, B., et al. Alternative Progenitor Cells Compensate to Rebuild the Coronary Vasculature in Elabela- and Apj-Deficient Hearts. Developmental Cell. 42 (6), 655-666 (2017).
- Rhee, S., et al. Endothelial deletion of Ino80 disrupts coronary angiogenesis and causes congenital heart disease. Nature Communications. 9 (1), 368 (2018).
