Modelo In Vitro de Angiogénesis Coronaria
Summary
Los modelos in vitro de angiogénesis coronaria se pueden utilizar para el descubrimiento de los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria. Cultivos explantados in vitro de tejidos sinusales venosos y endocardio muestran un crecimiento robusto en respuesta al VEGF-A y muestran un patrón similar de expresión COUP-TFII como in vivo.
Abstract
Aquí, describimos un ensayo de cultivo in vitro para estudiar la angiogénesis coronaria. Los vasos coronarios alimentan el músculo cardíaco y son de importancia clínica. Los defectos en estos vasos representan riesgos graves para la salud, como en la aterosclerosis, que puede provocar infartos de miocardio e insuficiencias cardíacas en los pacientes. En consecuencia, la enfermedad de las arterias coronarias es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. A pesar de su importancia clínica, se ha avanzado relativamente poco en cómo regenerar las arterias coronarias dañadas. Sin embargo, se han realizado progresos recientes en la comprensión del origen celular y las vías de diferenciación del desarrollo de los vasos coronarios. El advenimiento de herramientas y tecnologías que permiten a los investigadores etiquetar fluorescentemente las células progenitoras, seguir su destino y visualizar progenies in vivo han sido fundamentales para entender el desarrollo de los vasos coronarios. Los estudios in vivo son valiosos, pero tienen limitaciones en términos de velocidad, accesibilidad y flexibilidad en el diseño experimental. Alternativamente, los modelos in vitro precisos de la angiogénesis coronaria pueden eludir estas limitaciones y permitir a los investigadores interrogar cuestiones biológicas importantes con rapidez y flexibilidad. La falta de sistemas modelo in vitro adecuados puede haber obstaculizado el progreso en la comprensión de los mecanismos celulares y moleculares del crecimiento de los vasos coronarios. Aquí, describimos un sistema de cultivo in vitro para cultivar vasos coronarios a partir del sinusuvenosus (SV) y el endocardio (Endo), los dos tejidos progenitores de los que surgen muchos de los vasos coronarios. También confirmamos que las culturas recapitulan con precisión algunos de los mecanismos in vivo conocidos. Por ejemplo, mostramos que los brotes angiogénicos en cultivo a partir de SV downregulate EXPRESIÓN COUP-TFII similar a lo que se observa in vivo. Además, demostramos que el VEGF-A, un conocido factor angiogénico in vivo, estimula de forma robusta la angiogénesis de las culturas SV y Endo. Colectivamente, hemos ideado un modelo de cultivo in vitro preciso para estudiar la angiogénesis coronaria.
Introduction
Los vasos sanguíneos del corazón se denominan comúnmente vasos coronarios. Estos vasos se componen de arterias, venas y capilares. Durante el desarrollo, los capilares altamente ramificados se establecen primero, que luego se remodelan en arterias coronarias y venas1,2,3,4,5. Estos capilares iniciales se construyen a partir de células progenitoras endoteliales que se encuentran en los tejidos proepicardium, sinus venosus (SV) y endocardio (Endo)1,6,7,8. SV es el órgano de entrada del corazón embrionario y Endo es el revestimiento interno del lumen del corazón. Las células progenitoras endoteliales que se encuentran en el SV y Endo construyen la mayoría de la vasculatura coronaria, mientras que el propicaredium contribuye a una porción relativamente pequeña de ella2. El proceso por el cual la red capilar de los vasos coronarios crece en el corazón a partir de sus células precursoras preexistentes se llama angiogénesis coronaria. La enfermedad de las arterias coronarias es una de las principales causas de muerte en todo el mundo y, sin embargo, falta un tratamiento eficaz para esta enfermedad. Comprender los mecanismos celulares y moleculares detallados de la angiogénesis coronaria puede ser útil para diseñar terapias novedosas y eficaces para reparar y regenerar las arterias coronarias dañadas.
Recientemente, un aumento en nuestra comprensión de cómo se desarrollan los vasos coronarios se ha logrado en parte a través del desarrollo de nuevas herramientas y tecnologías. En particular, el etiquetado del linaje in vivo y las tecnologías avanzadas de imagen han sido muy útiles para descubrir las vías de origen celular y diferenciación de los vasos coronarios9,10,11,12. A pesar de las ventajas de estas herramientas in vivo, existen limitaciones en términos de velocidad, flexibilidad y accesibilidad. Por lo tanto, los sólidos sistemas de modelos in vitro pueden complementar los sistemas in vivo para dilucidar los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria de una manera de alto rendimiento.
Aquí, describimos un modelo in vitro de angiogénesis coronaria. Hemos desarrollado un sistema de cultivo explanta in vitro para cultivar vasos coronarios a partir de dos tejidos progenitores, SV y Endo. Con este modelo, mostramos que los cultivos explantadores de tejido in vitro crecen brotes de vasos coronarios cuando son estimulados por medio de crecimiento. Además, los cultivos explantadores crecen rápidamente en comparación con el control cuando son estimulados por el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A), una proteína angiogénica muy potente. Además, encontramos que los brotes angiogénicos del cultivo SV sufren desdiferencia venosa (pérdida de la expresión COUP-TFII), un mecanismo similar a la angiogénesis SV in vivo1. Estos datos sugieren que el sistema de cultivo explanta in vitro restablece fielmente los eventos angiogénicos que se producen in vivo. Colectivamente, los modelos in vitro de angiogénesis que se describen aquí son ideales para sondear los mecanismos celulares y moleculares de la angiogénesis coronaria de una manera accesible y de alto rendimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Algunos de los pasos más críticos para el crecimiento con éxito de los vasos coronarios de los tejidos progenitores SV y Endo son: 1) Identificar y aislar correctamente el tejido SV para el cultivo de SV; 2) el uso de ventrículos de embriones entre las edades de e11-11,5 para un cultivo preciso de Endo; 3) mantener condiciones estériles durante todo el período de disección y mantener los tejidos fríos en todo momento; y 4) mantener los explantes unidos a la membrana recubierta de ECM para evitar que el tejido flo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Sharma por proporcionar un entorno de investigación de apoyo. Nos gusta dar las gracias especiales a Diane (Dee) R. Hoffman, que mantiene y cuida de nuestra colonia de ratones. También nos gustaría dar las gracias a los doctores Philip J. Smaldino y Carolyn Vann por revisar a fondo el manuscrito y proporcionar comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por fondos de Ball State University Provost Office y Department of Biology a B.S, Indiana Academy of Sciences Senior Research Grant fondos a B.S, y NIH (RO1-HL128503) y The New York Stem Cell Foundation fondos a K.R.
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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