कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के विट्रो मॉडल में
Summary
कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के इन विट्रो मॉडल का उपयोग कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सेलुलर और आणविक तंत्र की खोज के लिए किया जा सकता है। इन इन इनिनस वेनसस सऔर एंडोकार्डियम ऊतकों की संस्कृतियों को वीवेएफ-ए के जवाब में मजबूत वृद्धि दिखाती है और वीवो में तख्तापलट-टीएफआईआई अभिव्यक्ति का एक समान पैटर्न प्रदर्शित करती है।
Abstract
यहां, हम कोरोनरी एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो संस्कृति परख का वर्णन करते हैं। कोरोनरी जहाजदिल की मांसपेशी खिलाते हैं और नैदानिक महत्व के होते हैं। इन जहाजों में दोष गंभीर स्वास्थ्य जोखिमों का प्रतिनिधित्व करते हैं जैसे कि एथेरोस्क्लेरोसिस में, जो रोगियों में मायोकार्डियल इंफेक्शन और दिल की विफलताओं का कारण बन सकता है। नतीजतन, कोरोनरी धमनी रोग दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक है । इसके नैदानिक महत्व के बावजूद, क्षतिग्रस्त कोरोनरी धमनियों को पुनर्जीवित करने के तरीके पर अपेक्षाकृत कम प्रगति की गई है। फिर भी, कोरोनरी पोत विकास के सेलुलर मूल और भेदभाव रास्तों को समझने में हाल ही में प्रगति हुई है । उपकरणों और प्रौद्योगिकियों का आगमन जो शोधकर्ताओं को जनक कोशिकाओं को फ्लोरोसेंटी लेबल करने, उनके भाग्य का पालन करने और वीवो में संतानकी कल्पना करने की अनुमति देते हैं, कोरोनरी पोत विकास को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। वीवो अध्ययन में मूल्यवान हैं, लेकिन प्रयोगात्मक डिजाइन में गति, पहुंच और लचीलेपन के मामले में सीमाएं हैं। वैकल्पिक रूप से, कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सटीक इन विट्रो मॉडल इन सीमाओं को दरकिनार कर सकते हैं और शोधकर्ताओं को गति और लचीलेपन के साथ महत्वपूर्ण जैविक प्रश्नों से पूछताछ करने की अनुमति देसकते हैं। उपयुक्त इन विट्रो मॉडल प्रणालियों की कमी कोरोनरी पोत विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने में प्रगति में रुकावट हो सकती है । यहां, हम एक इन विट्रो संस्कृति प्रणाली का वर्णन करने के लिए सिनोस वेनसस (एसवी) और एंडोकार्डियम (Endo), दो जनक ऊतकों से कोरोनरी जहाजों के कई पैदा से कोरोनरी जहाजों विकसित हो जाना । हमने यह भी पुष्टि की है कि संस्कृतियों सही वीवो तंत्र में ज्ञात में से कुछ संक्षिप्त । उदाहरण के लिए, हम बताते हैं कि एसवी से संस्कृति में एंजियोजेनिक अंकुरित तख्तापलट-TFII अभिव्यक्ति को कम करते हैं जो वीवो में मनाया जाता है। इसके अलावा, हम बताते हैं कि वीवो में एक प्रसिद्ध एंजियोजेनिक कारक VEGF-A, एसवी और एंडो संस्कृतियों दोनों से एंजियोजेनेसिस को मजबूती से उत्तेजित करता है। सामूहिक रूप से, हमने कोरोनरी एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक सटीक इन विट्रो संस्कृति मॉडल तैयार किया है।
Introduction
दिल की रक्त वाहिकाओं को आमतौर पर कोरोनरी वाहिकाएं कहा जाता है। इन जहाजों में धमनियां, नसें और केशिकाएं शामिल हैं। विकास के दौरान, अत्यधिक शाखाओं वाले केशिकाओं को पहले स्थापित किया जाता है, जो तब कोरोनरी धमनियों और नसों1,2,3,4,5में फिर से तैयार होते हैं। ये प्रारंभिक केशिकाएं प्रोपिकार्डियम, सिनोस वेनसस (एसवी) और एंडोकार्डियम (एंडो)ऊतक1,6,7,8में पाए जाने वाले एंडोथेलियल प्रोजेनिटर कोशिकाओं से बनाई गई हैं। एसवी भ्रूणीय हृदय का प्रवाह अंग है और एंडो दिल के लुमेन की आंतरिक परत है। एसवी और एंडो में पाए जाने वाले एंडोथेलियल प्रोजेनिटर कोशिकाएं कोरोनरी वास्कुल्चर के बहुमत का निर्माण करती हैं, जबकि प्रोपिकार्डियम इसके अपेक्षाकृत छोटे हिस्से में योगदान देताहै। जिस प्रक्रिया से कोरोनरी जहाजों का केशिका नेटवर्क अपने पहले से मौजूद अग्रदूत कोशिकाओं से दिल में बढ़ता है, उसे कोरोनरी एंजियोजेनेसिस कहा जाता है। कोरोनरी धमनी रोग दुनिया भर में मौत के प्रमुख कारणों में से एक है और अभी तक इस बीमारी के लिए एक प्रभावी उपचार की कमी है । कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के विस्तृत सेलुलर और आणविक तंत्र को समझना क्षतिग्रस्त कोरोनरी धमनियों की मरम्मत और पुनर्जीवित करने के लिए उपन्यास और प्रभावी उपचार डिजाइन करने में उपयोगी हो सकता है।
हाल ही में, कैसे कोरोनरी जहाजों का विकास के बारे में हमारी समझ में वृद्धि नए उपकरणों और प्रौद्योगिकियों के विकास के माध्यम से हासिल भाग में किया गया है । विशेष रूप से, वीवो वंश लेबलिंग और उन्नत इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में कोरोनरी जहाजों9,10, 11,12के सेलुलर मूल और विभेदन रास्तों को उजागर करने में बहुत उपयोगी रहा है । वीवो टूल्स में इनके फायदों के बावजूद, गति, लचीलापन और पहुंच के मामले में सीमाएं हैं। इसलिए, मजबूत इन विट्रो मॉडल सिस्टम कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सेलुलर और आणविक तंत्र को उच्च-थ्रूपुट तरीके से स्पष्ट करने के लिए वीवो सिस्टम में पूरक हो सकते हैं।
यहां, हम कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के इन विट्रो मॉडल का वर्णन करते हैं। हमने दो जनक ऊतकों, एसवी और एंडो से कोरोनरी जहाजों को विकसित करने के लिए एक इन विट्रो एक्सप्लांट संस्कृति प्रणाली विकसित की है। इस मॉडल के साथ, हम बताते है कि इन विट्रो ऊतक एक्सप्लांट संस्कृतियों कोरोनरी पोत अंकुरित हो जाना जब विकास माध्यम से उत्तेजित । इसके अतिरिक्त, एक्सप्लांट संस्कृतियां नियंत्रण की तुलना में तेजी से बढ़ती हैं जब संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर ए (VEGF-A), एक अत्यधिक शक्तिशाली एंजियोजेनिक प्रोटीन द्वारा उत्तेजित होता है। इसके अलावा, हमने पाया कि एसवी संस्कृति से एंजियोजेनिक अंकुरित विषैले विडिशन (तख्तापलट-TFII अभिव्यक्ति की हानि) से गुजरते हैं, जो वीवो1में एसवी एंजियोजेनेसिस के समान तंत्र है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि इन विट्रो एक्सप्लांट कल्चर सिस्टम ईमानदारी से वीवो में होने वाली एंजियोजेनिक घटनाओं को बहाल करता है। सामूहिक रूप से, एंजियोजेनेसिस के इन विट्रो मॉडल जो यहां वर्णित हैं, कोरोनरी एंजियोजेनेसिस के सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच के लिए उच्च थ्रूपुट और सुलभ तरीके से आदर्श हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एसवी और एंडो प्रोजेनेटर ऊतकों से सफलतापूर्वक बढ़ते कोरोनरी जहाजों के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से कुछ हैं: 1) सही ढंग से पहचान और एसवी संस्कृति के लिए एसवी ऊतक अलग; 2) सटीक एंडो संस्कृति के लिए e11−11.5 की ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने शर्मा प्रयोगशाला के सदस्यों को सहायक शोध वातावरण प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया। हम डायने (डी) आर हॉफमैन को विशेष धन्यवाद देना पसंद करते हैं जो हमारे माउस कॉलोनी का रखरखाव और परवाह करता है। हम डीआरएस फिलिप जे स्माल्डिनो और कैरोलिन वेन को पांडुलिपि को अच्छी तरह से प्रूफरीडिंग करने और सहायक टिप्पणियां प्रदान करने के लिए भी धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को बॉल स्टेट यूनिवर्सिटी प्रोवोस्ट ऑफिस और डिपार्टमेंट ऑफ बायोलॉजी से लेकर बीएस, इंडियाना एकेडमी ऑफ साइंसेज सीनियर रिसर्च ग्रांट फंड्स टू बीएस और एनआईएच (आरओ1-एचएल128503) और न्यूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन फंड ्स से केआर को फंड देकर सपोर्ट किया गया ।
Materials
| 100 x 20 MM Tissue Culture Dish | Fisher Scientific | 877222 | Referred in the protocol as Petri dish |
| 24-well plates | Fisher Scientific | 08-772-51 | |
| 8.0 uM PET membrane culture inserts | Millipore Sigma | MCEP24H48 | |
| Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555 | Fisher Scientific | A31572 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor Donkey anti-rat 488 | Fisher Scientific | A21206 | Secondary antibody |
| Angled Metal Probe | Fine science tools | 10088-15 | Angled 45 degree, used for detecting deep plugs |
| Anti- ERG 1/2/3 antibody | Abcam | Ab92513 | Primary antibody |
| Anti- VE-Cadherin antibody | Fisher Scientific | BDB550548 | Primary antibody, manufacturer BD BioSciences |
| CO2 gas tank | Various suppliers | N/A | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13998223 | For 37 °C, 5% CO2 incubation |
| Dissection stereomicrosope | Leica | S9i | Leica S9i Stereomicroscope |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | Endothelial cell growth basal media |
| ECM solution | Corning | 354230 | Commercially known as Matrigel |
| EGM-2 MV Singlequots Kit | Lonza | CC-4147 | Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007003IR | |
| FiJi | NIH | NA | Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads) |
| Fine Forceps | Fine science tools | 11412-11 | Used for embryo dissection |
| Fisherbrand Straight-Blade operating scissors | Fisher Scientific | 13-808-4 | |
| Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X) | Fisher Scientific | SH-302-5601LR | |
| Laminar flow tissue culture hood | Fisher Scientific | various models available | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1200 | Vectashield with DAPI |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy/Fisher | 50-980-494 | This is available at 32%; needs to be diluted to 4% |
| Perforated spoon | Fine science tools | 10370-18 | Useful in removing embryo/tissues from a solution |
| Recombinant Murine VEGF-A 165 | PeproTech | 450-32 | |
| Standard forceps, Dumont #5 | Fine science tools | 11251-30 | |
| Sure-Seal Mouse/Rat chamber | Easysysteminc | EZ-1785 | Euthanasia chamber |
References
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