In Vitro Modell av Koronar Angiogenese

Summary

In vitro modeller av koronar angiogenese kan brukes til oppdagelsen av cellulær og molekylære mekanismer for koronar angiogenese. In vitro explant kulturer av sinus venosus og endokardiet vev viser robust vekst som svar på VEGF-A og vise et lignende mønster av COUP-TFII uttrykk som i vivo.

Abstract

Her beskriver vi en in vitro kulturanalyse for å studere koronar angiogenese. Koronarfartøyene mater hjertemuskelen og er av klinisk betydning. Defekter i disse fartøyene representerer alvorlige helserisikoer som ved aterosklerose, noe som kan føre til hjerteinfarkt og hjertesvikt hos pasienter. Følgelig er koronarsykdom en av de viktigste dødsårsakene over hele verden. Til tross for sin kliniske betydning, relativt lite fremgang har blitt gjort på hvordan å regenerere skadede koronararterier. Likevel har det nylig gjort fremskritt for å forstå cellulær opprinnelse og differensieringsveier for koronarfartøyutvikling. Bruk av verktøy og teknologier som gjør det mulig for forskere å fluorescerende merke stamceller, følge deres skjebne, og visualisere avkom i vivo har vært medvirkende til å forstå koronar fartøyutvikling. In vivo studier er verdifulle, men har begrensninger i form av hastighet, tilgjengelighet og fleksibilitet i eksperimentell design. Alternativt kan nøyaktige in vitro-modeller av koronarangiogenese omgå disse begrensningene og tillate forskere å avhøre viktige biologiske spørsmål med hastighet og fleksibilitet. Mangelen på passende in vitro modellsystemer kan ha hindret fremdriften i å forstå cellulære og molekylære mekanismer for koronar fartøyvekst. Her beskriver vi et in vitro kultursystem for å dyrke koronarfartøy fra sinus venosus (SV) og endokardiet (Endo), de to stamfarvev ene og opp. Vi bekreftet også at kulturene nøyaktig rekapitulerer noen av de kjente in vivo-mekanismene. For eksempel viser vi at de angiogene spirene i kultur fra SV nedregulerer COUP-TFII-uttrykk som ligner på det som observeres in vivo. I tillegg viser vi at VEGF-A, en velkjent angiogen faktor in vivo, robust stimulerer angiogenese fra både SV- og Endo-kulturene. Samlet sett har vi utviklet en nøyaktig in vitro kulturmodell for å studere koronar angiogenese.

Introduction

Blodkar i hjertet kalles ofte koronarkar. Disse fartøyene består av arterier, årer og kapillærer. Under utvikling, svært forgrenede kapillærer er etablert først, som deretter ombygge til koronararterier og årer^1,2,3,4,5. Disse første kapillærene er bygget av endotelstamceller som finnes i proepikardiet, sinus venosus (SV) og endokardiet (Endo) vev^1,6,7,8. SV er tilsigsorganet av embryonisk hjerte og Endo er den indre foringen av hjertelumen. Endotelstamceller som finnes i SV og Endo bygger flertallet av koronarvaskulaturen, mens proepikardiet bidrar til en relativt liten del av det². Prosessen der kapillærnettverket av koronarkar vokser i hjertet fra sine eksisterende forløperceller kalles koronar angiogenese. Koronarsykdom er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden, og likevel mangler en effektiv behandling for denne sykdommen. Forstå detaljerte cellulære og molekylære mekanismer for koronar angiogenese kan være nyttig i å designe nye og effektive terapier for å reparere og regenerere skadede koronararterier.

Nylig har en økning i vår forståelse av hvordan koronarfartøy utvikler seg, delvis oppnås gjennom utvikling av nye verktøy og teknologier. Spesielt, in vivo avstamning merking og avansert bildeteknologi har vært svært nyttig i å avdekke cellulær opprinnelse og differensiering veier av koronar fartøy^9,10,11,12. Til tross for fordelene med disse in vivo-verktøyene, er det begrensninger når det gjelder hastighet, fleksibilitet og tilgjengelighet. Derfor kan robuste in vitro-modellsystemer utfylle in vivo-systemer for å belyse cellulære og molekylære mekanismer for koronar angiogenese på en høy gjennomstrømningsmåte.

Her beskriver vi en in vitro-modell av koronar angiogenese. Vi har utviklet et in vitro explant kultursystem for å dyrke koronarfartøy fra to stamcellevev, SV og Endo. Med denne modellen viser vi at in vitro vev explant kulturer vokse koronar fartøy spirer når stimulert av vekst medium. I tillegg vokser eksplantkulturene raskt sammenlignet med kontroll når de stimuleres av vaskulær endotelvekstfaktor A (VEGF-A), et svært potent angiogent protein. Videre fant vi at de angiogene spirene fra SV-kulturen gjennomgår venøs dedifferensiering (tap av COUP-TFII-uttrykk), en mekanisme som ligner SV angiogenese in vivo¹. Disse dataene tyder på at in vitro explant kultursystemet trofast gjeninnfører angigene hendelser som oppstår in vivo. Samlet, in vitro modeller av angiogenese som er beskrevet her er ideelle for sondering cellulær og molekylære mekanismer for koronar angiogenese på en høy gjennomstrømning og tilgjengelig måte.

Protocol

Bruk av alle dyrene i denne protokollen fulgte Ball State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) retningslinjer. 1. Etablere mus oppdrettere og oppdage vaginal plugger for tidsbestemt graviditeter Sett opp et museavlbur med villtype hann- og hunnmus. Sørg for at alderen på avlsmusene er mellom 6-8 uker. Sett opp enten et par (1 mann og 1 kvinne) eller som en trio (1 mann og 2 kvinne) for avl. Se etter en vaginal plugg neste morgen. Bruk en vinklet …

Representative Results

En av de mest slående funksjonene i SV angiogenese in vivo er at den følger en bestemt vei og innebærer cellededifferensiering og redifferensiering hendelser som oppstår på stereotypiske tider og posisjoner1. Som innledende SV-celler vokser på hjertet ventrikkel, de slutter å produsere venøse markører som COUP-TFII (Figur 7). Deretter tar koronarspirer to migrasjonsstier, enten over hjertets overflate eller dypt inne i myokard…

Discussion

Noen av de mest kritiske trinnene for vellykket voksende koronarfartøy fra SV og Endo stamcellevev er: 1) Korrekt identifisering og isolere SV-vevet for SV-kultur; 2) ved hjelp av ventrikler fra embryoer mellom e11-11,5 år for nøyaktig Endo kultur; 3) opprettholde sterile forhold gjennom disseksjonsperioden og holde vevet kaldt til enhver tid; og 4) holde explants festet til ECM belagt membran for å unngå vev flyter i mediet.

For det første kan isolasjon av SV-vev være utfordrende. Det …

Materials

100 x 20 MM Tissue Culture Dish	Fisher Scientific	877222	Referred in the protocol as Petri dish
24-well plates	Fisher Scientific	08-772-51
8.0 uM PET membrane culture inserts	Millipore Sigma	MCEP24H48
Alexa Fluor Donkey anti-rabbit 555	Fisher Scientific	A31572	Secondary antibody
Alexa Fluor Donkey anti-rat 488	Fisher Scientific	A21206	Secondary antibody
Angled Metal Probe	Fine science tools	10088-15	Angled 45 degree, used for detecting deep plugs
Anti- ERG 1/2/3 antibody	Abcam	Ab92513	Primary antibody
Anti- VE-Cadherin antibody	Fisher Scientific	BDB550548	Primary antibody, manufacturer BD BioSciences
CO2 gas tank	Various suppliers	N/A
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13998223	For 37 °C, 5% CO2 incubation
Dissection stereomicrosope	Leica	S9i	Leica S9i Stereomicroscope
EBM-2 basal media	Lonza	CC-3156	Endothelial cell growth basal media
ECM solution	Corning	354230	Commercially known as Matrigel
EGM-2 MV Singlequots Kit	Lonza	CC-4147	Microvascular endothelial cell supplement kit; This is mixed into the EBM-2 to make the EGM-2 complete media
Fetal Bovine Serum (FBS)	Fisher Scientific	SH3007003IR
FiJi	NIH	NA	Image processing software (https://imagej.net/Fiji/Downloads)
Fine Forceps	Fine science tools	11412-11	Used for embryo dissection
Fisherbrand Straight-Blade operating scissors	Fisher Scientific	13-808-4
Hyclone Phosphate Buffered Saline (1X)	Fisher Scientific	SH-302-5601LR
Laminar flow tissue culture hood	Fisher Scientific	various models available
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1200	Vectashield with DAPI
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy/Fisher	50-980-494	This is available at 32%; needs to be diluted to 4%
Perforated spoon	Fine science tools	10370-18	Useful in removing embryo/tissues from a solution
Recombinant Murine VEGF-A 165	PeproTech	450-32
Standard forceps, Dumont #5	Fine science tools	11251-30
Sure-Seal Mouse/Rat chamber	Easysysteminc	EZ-1785	Euthanasia chamber