Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Published: July 7, 2020 doi: 10.3791/61612
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Texas at Arlington

Summary

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Abstract

Transposon sequencing (Tn-seq) is een krachtige methode die transposon mutagenesis en massieve parallelle sequencing combineert om genen en paden te identificeren die bijdragen aan bacteriële fitness onder een breed scala van omgevingsomstandigheden. Tn-seq toepassingen zijn uitgebreid en hebben niet alleen het onderzoek van genotype-fenotype relaties op organisme niveau, maar ook op de bevolking, gemeenschap en systemen niveaus. Gram-negatieve bacteriën zijn sterk geassocieerd met antimicrobiële resistentie fenotypes, die incidenten van antibiotica behandeling falen heeft verhoogd. Antimicrobiële resistentie wordt gedefinieerd als bacteriële groei in de aanwezigheid van anders dodelijke antibiotica. De "last-line" antimicrobiële colistin wordt gebruikt voor de behandeling van gram-negatieve bacteriële infecties. Echter, verschillende Gram-negatieve ziekteverwekkers, waaronder Acinetobacter baumannii kan ontwikkelen colistine resistentie door middel van een reeks van moleculaire mechanismen, waarvan sommige werden gekenmerkt met behulp van Tn-seq. Bovendien, signaal transductie trajecten die colistin resistentie reguleren variëren binnen Gram-negatieve bacteriën. Hier stellen we een efficiënte methode voor om mutagenesis in A. baumannii te transtreren die de generatie van een verzadigende transposon insertiebibliotheek en amplicon bibliotheekbouw stroomlijnt door de noodzaak van beperkingsenzymen, adapterligatie en gelzuivering te elimineren. De hierin beschreven methoden maken een diepgaande analyse mogelijk van moleculaire determinanten die bijdragen aan A. baumannii-geschiktheid wanneer ze worden uitgedaagd met colistine. Het protocol is ook van toepassing op andere Gram-negatieve ESKAPE-pathogenen, die. voornamelijk geassocieerd worden met resistente ziekenhuisinfecties.

Introduction

De ontdekking van antibiotica is ongetwijfeld een van de meest impactvolle gezondheidsgerelateerde gebeurtenissen van de20e eeuw. Niet alleen antibiotica snel oplossen ernstige bacteriële infecties, ze spelen ook een centrale rol in de moderne geneeskunde. Grote operaties, transplantaties en vooruitgang in de neonatale geneeskunde en chemotherapie verlaten patiënten die vatbaar zijn voor levensbedreigende infecties en deze therapieën zouden niet mogelijk zijn zonder antibiotica1,2. De snelle ontwikkeling en verspreiding van antibioticaresistentie onder menselijke pathogenen heeft echter de werkzaamheid van alle klinisch belangrijke klassen van antibiotica aanzienlijk verminderd3. Veel bacteriële infecties die ooit gemakkelijk werden gewist met antibiotica behandeling, niet langer reageren op klassieke behandeling protocollen, waardoor een ernstige bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid1. Antimicrobiële resistentie (AMR) is waar bacteriële cellen groeien in anders dodelijke concentraties van antibiotica, ongeacht de behandelingsduur4,5. Er is een dringende noodzaak om moleculaire en biochemische factoren te begrijpen die AMR reguleren, wat zal helpen bij het begeleiden van alternatieve antimicrobiële ontwikkeling. Specifiek, ESKAPE pathogenen zijn problematisch in klinische omgevingen en geassocieerd met uitgebreide AMR. Deze omvatten Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa en Enterobacter spp. Hoewel verschillende mechanismen bijdragen aan AMR in ESKAPE-pathogenen, zijn de laatste vier organismen gramneg negatief.

Gram-negatieve bacteriën monteren een bepalend buitenste membraan dat hen beschermt tegen ongunstige omgevingsomstandigheden. Het buitenste membraan dient als een doorlaatbaarheidsbarrière om de toegang van giftige moleculen, zoals antibiotica, in de cel te beperken. In tegenstelling tot andere biologische membranen is het buitenste membraan asymmetrisch. De buitenste bijsluiter is verrijkt met aan de oppervlakte blootgestelde lipopolysaccharide, terwijl de binnenste bijsluiter een mengsel is van fosfolipiden6. Lipopolysaccharide moleculen zijn verankerd aan het buitenste membraan door een geconserveerde lipide A moiety ingebed in de lipide bilayer7. Het canonieke lipide A-domein van Escherichia coli lipopolysaccharide is vereist voor de groei van de meeste Gram-negatieve bacteriën en wordt gesynthetiseerd door een negen-staps enzymatische route die een van de meest fundamentele en geconserveerde trajecten in Gram-negatieve organismen6,7,8is .

Polymyxinen zijn kationische antimicrobiële peptiden die zich richten op de lipide A domein van lipopolysaccharide om het buitenste membraan te verstoren en lyse de cel. De elektrostatische interactie tussen positief geladen residuen van polymyxinen en de negatief geladen lipide A-fosfaatgroepen verstoren het bacteriële celmembraan uiteindelijk tot celdood9,10,11,12,13. Colistine (polymyxine E) is een antimicrobiële in laatste instantie die wordt gebruikt voor de behandeling van infecties veroorzaakt door multiresistente gramnagende nosocomiale pathogenen, zoals Acinetobacter baumannii14,15,16. Voor het eerst ontdekt in 1947, polymyxinen worden geproduceerd door de bodembacteriën, Paenibacillus polymyxa17,18,19. Polymyxinen werden voorgeschreven om gram-negatieve infecties te behandelen voor de jaren voordat hun klinisch gebruik werd beperkt als gevolg van meldingen van significante nephro- en neurotoxiciteit20,21.

A. baumannii is een nosocomiale gramnegatieve ziekteverwekker die de morbiditeit en mortaliteit van de patiëntresultaten in de afgelopen decennia drastisch heeft verhoogd22. Wat ooit werd beschouwd als een ziekteverwekker met een lage dreiging, vormt nu een aanzienlijk risico voor ziekenhuisinfecties over de hele wereld vanwege zijn ongelooflijke vermogen om AMR te verwerven en een hoog risico opepidemie 23,24. A. baumannii is goed voor meer dan 10% van de nosocomiale infecties in de Verenigde Staten. Ziekte manifesteert zich als longontsteking, bacteremie, urineweginfecties, huid- en weke delen infecties, meningitis, en endocarditis25. Behandelingsopties voor A. baumannii-infecties zijn afgenomen als gevolg van resistentie tegen bijna alle antibioticaklassen, waaronder β-lactams, fluoroquinolonen, tetracycline en aminoglycosides23,24. De prevalentie van multiresistente, langdurig resistente en panresistente A. baumannii isolaten heeft geleid tot een opleving in de colistine behandeling, waarvan werd gedacht dat het een van de weinige overgebleven therapeutische opties nog steeds effectief tegen multidrug resistente A. baumannii. De toegenomen colistineresistentie onder A. baumannii-isolaten heeft echter zijn bedreiging voor de mondiale volksgezondheid verder versterkt10,11,,12,13,27,30,31.

Recente vooruitgang in high-throughput sequencing technologieën, zoals transposon sequencing (Tn-seq), hebben belangrijke instrumenten om ons begrip van bacteriële fitness in vitro en in vivote bevorderen. Tn-seq is een krachtig hulpmiddel dat kan worden ingezet om genotype-fenotype interacties in bacteriën te bestuderen. Tn-seq is breed toepasbaar voor bacteriële pathogenen, waarbij het traditionele transposon mutagenesis combineert met massieve parallelle sequencing om snel invoegingsplaatsen in kaart te brengen, die kunnen worden gebruikt om DNA-mutaties te koppelen aan fenotypische varianten op een genoombrede schaal32,33,34,35. Hoewel transposon mutagenesis methoden zijn eerder beschreven, de algemene stappen zijn vergelijkbaar33. Ten eerste wordt een invoegbibliotheek gegenereerd met behulp van transposon mutagenesis, waarbij elke bacteriële cel binnen een populatie beperkt is tot één transposon invoeging binnen het genomische DNA (gDNA). Na mutagenesis worden individuele mutanten samengevoegd. gDNA wordt gewonnen uit de invoegpot en de transposon-knooppunten worden versterkt en onderworpen aan hoge doorvoersequencing. De reads vertegenwoordigen invoegplaatsen, die in kaart kunnen worden gebracht aan het genoom. Transposon inserties die de conditie te verminderen snel uit de bevolking vallen, terwijl gunstige toevoegingen zijn verrijkt. Tn-seq is instrumenteel geweest om ons begrip van hoe genen bacteriële fitness beïnvloeden in stress33te bevorderen.

Het Himar1 mariner transposon systeem gecodeerd in pJNW684 werd specifiek gebouwd en geoptimaliseerd voor de omzetting van mutagenesis. Het omvat een mariner-familietransposon flankeren van de kanamycine resistentie gen, die wordt gebruikt voor de selectie van transposon insertion mutanten in A. baumannii. Het codeert ook een A. baumannii specifieke promotor die de expressie van de transposase codering gen36drives . De op zeeherengebaseerde transposon bevat ook twee translationele terminators stroomafwaarts van het kanamycine resistentiegen, dat lees-door stroomafwaarts van de invoeging37voorkomt. pJNW684 draagt ook een RP4/oriT/oriR6K-voorwaardelijke oorsprong van replicatie die vereist dat het λpir-gen dat door de donorstam wordt bijgedragen, zich vermenigvuldigt38. Bij afwezigheid van het λpir-gen zal de pJNW684-vector die de omzettingsmachine draagt, zich niet kunnen vermenigvuldigen in de A. baumannii-ontvangerstam 10,36,38. Daarom wordt tijdens bacteriële vervoeging alleen het transposon in het ontvangende genoom ingebracht zonder achtergrondinbrengen van het plasmide, dat het transposasegen draagt. Dit is belangrijk omdat het verlies van transposase activiteit samen met de plasmide resulteert in een enkele, stabiele omzetting gebeurtenis die voorkomt dat de transposon zich naar verschillende locaties zodra het invoegt in de ontvanger genoom.

pJNW648 is ook getest op activiteit in een ander Gram-negatief organisme, E. coli. Succesvolle assemblage van een verzadigende Tn-seq bibliotheek in E. coli stam W3110 gaf aan dat het systeem vatbaar is om mutagenese uit te voeren in een breed scala van ziekteverwekkers, waaronder Enterobacteriaceae. Bovendien kan de A. baumannii-specifieke promotor die de omzettingsexpressie stimuleert, snel worden uitgewisseld met een soortspecifieke promotor. Ten slotte kan het kanamycineresistentiegen worden ingeruild voor andere weerstandscassettes, afhankelijk van het AMR-fenotype van het onderzochte organisme.

Een factor die bijdraagt aan de resistentie van colistine in A. baumannii is toediening van onvoldoende doses, waarbij bacteriën worden blootgesteld aan selectieve druk op niet-dodelijke niveaus39. Verschillende rapporten toonden aan dat subinhibitory antimicrobiële concentraties gereguleerde reacties kunnen veroorzaken die de celfysiologie veranderen om de gevoeligheid van de gehele bacteriële populatie te verminderen11,12,30,31. Met behulp van Tn-seq ontdekten we factoren die de colistineresistentie in A. baumannii-stam ATCC 17978 reguleren na blootstelling aan remmende10- en subinhibitorische concentraties van colistine. In dit voorbeeld wordt een Tn-seq-methode beschreven die de constructie en verrijking van een verzadigde transposon mutantbibliotheek stroomlijnt met behulp van de op marinergebaseerde familie van transposons40,41. Terwijl verschillende Tn-seq protocollen genereren 20.000 - 100.000 mutanten35,42,43,44,45,46, kan het hierin beschreven protocol snel een transposon bibliotheek van 400.000 + mutanten genereren, die ruwweg gelijk staat aan een transposon inbrengen elke 10-base paren in A. baumannii10. Bovendien kan de grootte van de bibliotheek zonder noemenswaardige extra inspanning worden opgeschaald. Deze methode elimineert ook de vereiste voor beperking endonucleases, adapter ligatie en gel zuivering, die de uiteindelijke bibliotheek diversiteit kan verminderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparaat van bacteriële stammen

  1. Streep de "donor" stam (E. coli MFD DAP-/pJNW684, Tabel van materialen) voor geïsoleerde kolonies op Luria-Bertani agar aangevuld met 600 μM diaminopimimlic zuur (DAP), 100 mg/L van ampicilline en 25 mg/L kanamycine. Incubeer 's nachts bij 37 °C. Met behulp van een enkele geïsoleerde kolonie, inentuleren 50 mL luria bouillon (LB) aangevuld met 600 μM DAP, 100 mg/L van ampicilline en 25 mg/L kanamycine in een 250 mL Erlenmeyer kolf en label het als "donor".
  2. Streep de "ontvanger" stam (A. baumannii stam ATCC 17978, Tabel van materialen) voor geïsoleerde kolonies op Luria-Bertani agar. Incubeer 's nachts bij 37 °C. Met behulp van een enkele geïsoleerde kolonie, inenting 50 mL van LB in een 250 mL Erlenmeyer fles en label het als "ontvanger".
  3. Broed beide culturen ("donor" en "ontvanger") 's nachts bij 37 °C met schudden.

2. Bacteriële paring

  1. Breng nachtelijke culturen over naar 50 mL conische buizen.
  2. Pellet zowel ontvanger en donor culturen met behulp van centrifugatie op 5.000 x g gedurende 7 min.
  3. Gooi de supernatant weg en zet de "donor" stampellet in 35 mL LB, aangevuld met DAP, terug om resterende antibiotica weg te spoelen.
  4. Pellet de "donor" stamcellen met behulp van centrifugatie op 5.000 x g gedurende 7 min.
  5. Gooi de supernatant weg en zet de "donor" stampellet in 4,5 mL LB, aangevuld met DAP, opnieuw op te zetten. Gebruik een serologische pipet van 10 mL.
  6. Breng de opnieuw opgetrokken "donor" stam in "ontvanger" stam buis, die de pelleted "ontvanger" cellen bevat. Gebruik dezelfde serologische pipet van 10 mL vanaf stap 2.5 om de culturen te mengen. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.
    LET OP: Het totale volume van de uiteindelijke ophanging moet 5 mL zijn.
  7. Verdeel de paringsspensie als afzonderlijke 100 μL druppels op LB agar platen aangevuld met DAP (5-7 druppels per plaat) (figuur 1A).
  8. Incubeerplaten bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  9. Zonder de druppels te storen, breng je borden voorzichtig over naar een couveuse van 37 °C en laat je culturen 1 uurparen.
    OPMERKING: Incubatieperioden van meer dan 1 uur riskeren het genereren van zustermutanten.
  10. Voeg na incubatie 1,5 mL LB toe aan elke plaat en oogst door bacteriën uit de platen te verwijderen. Gebruik een 1 mL micropipet voor resuspension. Het eindvolume moet ongeveer 12 - 15 mL bedragen.
  11. Combineer geoogste cellen in een conische buis van 50 mL.
  12. Pellet de gedekte cellen met behulp van centrifugatie op 5.000 x g gedurende 7 min.
  13. Gooi de supernatant en resuspend cellen in 50 mL van LB om resterende DAP te verwijderen.
  14. Pellet de paring met behulp van centrifugatie op 5.000 x g gedurende 7 min.
  15. Herhaal de wasstap (stap 2.13 en 2.14).
  16. Met behulp van een serologische pipet van 10 mL, wordt de pellet opnieuw gemonteerd in 10 mL LB aangevuld met 25% glycerol.
  17. Maak met behulp van gewassen cellen vijf seriële verdunningen in LB-bouillon (1:10, 1:1000, 1:10.000, 1:100.000).
  18. Verspreid 100 μL van elke verdunning op 4 verschillende platen met behulp van steriele glazen kralen: Luria-Bertani agar aangevuld met kanamycine, agar aangevuld met ampicilline, agar aangevuld met DAP en agar alleen.
  19. Incubeer platen bij 37 °C 's nachts.
  20. Aliquot de resterende paring in 1 mL aliquots en op te slaan op -80 °C.

3. De juiste verdunning van de transposonbibliotheek bepalen

  1. Record kolonie-vormende eenheden (CFU) van 's nachts platen.
  2. Beeld een plaat met telbare kolonies voor elke verschillende plaatconditie(Figuur 2A).
    OPMERKING: Zowel "donor" en "ontvanger" stammen moeten groeien op agar platen aangevuld met DAP, dus de meeste vergulde verdunningen zal een gazon opleveren. Alleen de "ontvanger" stam kan groeien op agar platen. Noch de "donor" noch de "ontvanger" stam kan groeien op agar platen aangevuld met ampicilline, dus er moet geen / minimale groei. Alleen doelstamcellen die de omzetting van de omzetting inbrengen coderen, kunnen groeien op agarplaten aangevuld met kanamycine. Kolonies moeten variëren in grootte, wat wijst op transposon inserties in genen die bijdragen aan fitness op agar aangevuld met kanamycine.
  3. Bereken het aantal transposon mutanten in de bevroren paring door het tellen van het aantal kolonies op LB agar platen aangevuld met kanamycine.
    OPMERKING: Voor het A. baumannii genoom (ongeveer 4 Mbps) was het doel om ongeveer 400.000 kolonies te verkrijgen om een hoge resolutie mutantbibliotheek te genereren (ongeveer één transposon insertion/10 base pairs). Dit aantal moet echter worden geoptimaliseerd op basis van de genoomgrootte van de doelsoort).

4. Generatie van de definitieve bacteriële mutant bibliotheek

  1. Ontdooi een aliquot van de bevroren paring op ijs.
  2. Plaat paring op 150 mm Luria-Bertani agar platen aangevuld met kanamycine op basis van CFUs berekend in stap 3.1. Pas het volume met LB aan om 13.333 kolonies per 150 μL op te leveren alvorens te beplating.
    OPMERKING: De CFU telling hier werd vastgesteld op ongeveer 105 CFU / mL, dus de paring volume werd aangepast aan 13.333 kolonies per plaat te verkrijgen als dit zou een optimaal aantal kolonies op 30 platen voor een hoge resolutie mutant bibliotheek te bieden zonder overbevolking van de platen.
  3. Gebruik steriele glazen kralen om 150 μL van de verdunning per plaat te verspreiden op 30 x 150 mm Luria-Bertani agar platen aangevuld met kanamycine om 400.000 kolonies te verkrijgen (Figuur 1C).
    OPMERKING: Steriele staven of enige vorm van steriele spreader tool (d.w.z. glazen kralen) kunnen worden gebruikt om de bacteriën op platen te verspreiden.
  4. Gooi de gebruikte buis met overtollige paring weg.
    OPMERKING: Vries/dooicycli voegt selectieve druk toe op de bacteriecultuur, die de resultaten van het Tn-seq-experiment kan scheeftrekken. Gebruik een verse aliquot elke keer.
  5. Incubeerplaten bij 37 °C gedurende 14 uur.
    OPMERKING: De incubatietijd is geoptimaliseerd om overgroei te voorkomen (kolonies raken). Het minimaliseren van de groei door het verminderen van de incubatietijd wordt voorgesteld.

5. Schatting van bibliotheekdichtheid en pooling voor opslag

  1. Tel CFUs op elke plaat om de totale mutanten in de transposon bibliotheek te schatten. Tel 20% van ten minste 3 platen om de schatting van het kolonieaantal voor de gehele groep platen te bepalen(figuur 2A). Zorg ervoor dat de kolonies geen andere kolonie aanraken.
  2. Voeg na het berekenen van de geschatte kolonieopbrengst 3-5 mL LB (of meer indien nodig) toe aan elke plaat en schraap de bacteriën af met behulp van een steriel schraapgereedschap.
    OPMERKING: Steriele inentenlussen werden gebruikt om platen efficiënt te schrapen.
  3. Pool bacteriële suspensies van alle platen in 50 mL conische buizen(figuur 1D). Hiervoor zijn meerdere conische buizen van 50 mL nodig, minstens 3.
  4. Pellet samengevoegd bacteriële suspensie met behulp van centrifugatie op 5.000 x g gedurende 7 min.
  5. Gooi de supernatant en resuspend pellet in 5 mL van LB aangevuld met 30% glycerol.
  6. Aliquot 1 mL van de transposon bibliotheek in cryovials en winkel bij -80 °C.

6. Identificatie van factoren die de colistinresistentie in A. baumannii reguleren

  1. Bereid 4 x 250 mL Erlenmeyer flessen met elk 50 mL LB bouillon en etiket als (Figuur 2B)
    1. A. baumannii stam ATCC 17978 Tn-seq bibliotheek; (-) colistin_1
    2. A. baumannii stam ATCC 17978 Tn-seq bibliotheek; (-) colistin_2
    3. A. baumannii stam ATCC 17978 Tn-seq bibliotheek; (+) colistin_1
    4. A. baumannii stam ATCC 17978 Tn-seq bibliotheek; (+) colistin_2
      LET OP: In de uitdaging groei hier beschreven, elke voorwaarde, (-) colistin controle en (+) colistin uitdaging, wordt getest in tweevoud. Daarom vereist de setup 4 x 250 mL Erlenmeyer kolven, twee per voorwaarde.
  2. Voeg 50 μL 0,5 mg/L-colistine toe aan (+) colistinekolven (6.1.3 en 6.1.4) en 50 μL water aan (-) colistinkolven (6.1.1 en 6.1.2).
  3. Ontdooi een bevroren Tn-seq bibliotheek aliquot vanaf stap 5 op ijs.
  4. Pipette 1 μL van de ontdooide bibliotheek in 1 mL PBS.
  5. Meet de optische dichtheid op 600 nm (OD600)en vermenigvuldig met 1.000.
    OPMERKING: Dit bepaalt OD600 van 1 μL van de Tn-bibliotheek.
  6. Op basis van de berekening in stap 6.5, inent inenten elke kolf met 50 mL LB tot een definitieve OD600 0,001.
  7. Kweek culturen in een schuddende couveuse bij 37 °C tot OD600 0,5.
    OPMERKING: Het is belangrijk dat culturen in logaritmische groeifase blijven, dus als uw stam zich tijdens een exponentiële groei op een andere OD600 bevindt, moet de OD600 worden aangepast om ervoor te zorgen dat de cultuur zo vaak mogelijk repliceert binnen de logaritmische groeifase. Als de cultuur slechts 3 keer repliceert, wordt de kracht om fitnessdefecten bij mutanten te detecteren in theorie beperkt tot 3-voudige verschillen. Aangezien verschillende bacteriën verschillende verdubbelingstijden hebben, is het belangrijk om de culturen op een vaste OD600 te zaaien om het beginnende entmateriaal te normaliseren. Dit zorgt voor een consistente weergave van de gehele bibliotheek in alle culturen.
  8. Oogst culturen met behulp van centrifugatie bij 5.000 x g bij 4 °C gedurende 7 min.
  9. Verwijder de supernatant en was met 50 mL PBS.
  10. Pellet met behulp van centrifugatie bij 5.000 x g bij 4 °C gedurende 7 minuten.
  11. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 1 mL PBS. Aliquot ~ 200 μL in 5 microcentrifugebuizen.
  12. Pellet met behulp van centrifugatie bij 5.000 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten. Verwijder alle supernatant met behulp van een pipet tip.
  13. Bewaar pellets op -20 °C of ga verder met gDNA-extractie.

7. gDNA-extractie

  1. Ontdooi een celpellet op ijs.
  2. Voeg 0,6 mL lyse buffer (Tabel van materialen) en vortex om volledig resuspend de pellet.
  3. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
  4. Voeg 0,6 mL fenol/chloroform/isoamylalcohol krachtig toe aan het monster en vortex.
  5. Afzonderlijke fasen met behulp van centrifugatie in een microcentrifuge bij maximale snelheid bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  6. Breng de bovenste waterfase over op een nieuwe buis. Vermijd het verstoren van de fase-interface tijdens de overdracht.
  7. Voeg een gelijk volume chloroform toe aan de waterige fase die hierboven is verkregen en vortex krachtig.
  8. Afzonderlijke fasen met behulp van centrifugatie in microcentrifuge bij maximale snelheid bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  9. Breng de bovenste waterfase over naar een nieuwe buis.
    LET OP: Zorg ervoor dat u tijdens de overdracht de interface niet verstoort.
  10. Voeg 2,5x waterig fasevolume van koude 100 % ethanol toe en meng voorzichtig. Versneld DNA zal zichtbaar zijn.
  11. Plaats de buis op -80 °C gedurende ten minste 1 uur.
  12. Pellet DNA met behulp van centrifugatie bij maximale snelheid bij 4 °C gedurende 30 min.
  13. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de DNA-pellet te verstoren en was met 150 μL ethanol van 70 % door pipetteren.
  14. Pellet DNA met behulp van centrifugatie bij maximale snelheid bij 4 °C gedurende 2 min.
  15. Verwijder voorzichtig de supernatant.
  16. Herhaal stap 7.14 eenmaal. Verwijder voorzichtig alle resterende ethanol.
  17. Droog DNA door te broeden op kamertemperatuur gedurende 5-10 min.
  18. Resuspend DNA pellet in 100 μL TE buffer door pipetting.

8. DNA-afschuif (Figuur 3A)

  1. Verdun gDNA met TE-buffer tot een concentratie van 250 ng/mL in een totaal volume van 200 μL.
  2. Plaats buizen in een waterbad sonicator.
  3. Sonicate DNA om fragmenten van ongeveer 300 nucleotiden op te leveren. Vermogen: 60 %, totale tijd: 20 min, cycli: 10 s AAN en 10 s UIT bij 4 °C (figuur 3A).
  4. Bevestig DNA wordt op de juiste manier afgeschoren door 10 μL van ongehoord DNA en 10 μL afgeschoren DNA op een 1% agarosegel te scheiden. Herhaal sonicatie of optimaliseer indien nodig(figuur 3B).

9. Poly-C staart toevoeging aan het 3' einde (Figuur 3A)

  1. Setup poly-C reactie volgens tabel 1.
  2. Incubeerreactie bij 37 °C gedurende 1 uur.
  3. Zuiver poly-C-reactie met 40 μL van grootteselectie paramagnetische kralen (Figuur 3A) door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Voeg 40 μL van grootte-selectie paramagnetische kralen aan elk monster. Vortex ~ 5 s of pipet op en neer.
    2. Incubeermonsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    3. Kortom, centrifuge buizen om vloeistof te verzamelen in de bodem van de buis (~ 2 s).
    4. Breng buizen naar een magnetisch rek en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ~ 2 min totdat de oplossing duidelijk is.
    5. Verwijder met buizen op magnetisch rek voorzichtig de supernatant.
    6. Voeg met buizen op het magnetische rek 200 μL vers bereide 80% ethanol toe (stoor kralen niet).
    7. Incubeer monsters voor ten minste 30 s totdat de oplossing is duidelijk.
    8. Verwijder met buizen op magnetisch rek voorzichtig de supernatant.
    9. Herhaal de wasstap (stap 9.3.6 - 9.3.8).
    10. Verzamel vloeistof in de bodem van de buis met behulp van een korte centrifugatie stap (~ 2 s).
    11. Breng buizen over naar het magnetisch rek en verwijder de resterende vloeistof.
    12. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2-5 min om monsters te drogen. Niet te droog.
    13. Verwijder buizen uit het magnetisch rek en voeg 25 μL water toe aan elk. Vortex voor ~ 5 s of pipet op en neer.
    14. Kortom, centrifuge buizen om vloeistof te verzamelen in de bodem van de buis (~ 2 s).
    15. Breng buizen naar het magnetische rek en laat zitten voor ~ 2 min totdat de oplossing duidelijk is.
    16. Verwijder met buizen op het magnetische rek vloeistof zonder de kralen te storen en breng over naar een nieuwe buis (~ 23 μL DNA).

10. Omzetting van kruisingsversterking (figuur 3A)

  1. Setup PCR 1 zoals beschreven in tabel 1 voor de eerste geneste PCR(tabel 2).
  2. Voer PCR 1 uit met de in tabel 1 beschreven voorwaarden.
  3. Zuiver PCR-producten met 40 μL paramagnetische kralen (stappen 9.3.1 – 9.3-12). Elute in 50 μL water (stappen 9.3.13 – 9.3.16). Op dit punt kunnen de monsters worden opgeslagen bij -20 °C.
  4. Bereid Streptavidin-gekoppelde paramagnetische kralen:
    1. Resuspend Streptavidin kralen door krachtig te schudden.
    2. Voeg 32 μL kralen per monster toe aan een verse microcentrifugebuis.
      LET OP: Kralen voor 6 + monsters kunnen worden bereid in een enkele buis.
    3. Breng de buis over naar een magnetisch rek. Incubeer voor ~ 2 min tot de oplossing duidelijk is.
    4. Met buis op magnetisch rek, verwijder supernatant.
    5. Haal de buis uit het magnetisch rek. Was kralen door resuspending in 1 mL 1x B&W buffer door pipetting op en neer.
    6. Breng de buis over op een magnetisch rek. Incubeer voor ~ 2 min tot de oplossing duidelijk is.
    7. Verwijder met de buis op magnetisch rek de supernatant.
    8. Herhaal de wasstap met 1 mL 1x B&W buffer (stappen 10.4.5 – 10.4.7) twee maal meer voor een totaal van 3 wasbeurten.
    9. Verwijder de buis uit het magnetisch rek en de kralen in 52 μL van 2x B&W buffer per monster.
  5. Combineer 50 μL van de bereide kralen met 50 μL gezuiverde PCR1 (vanaf stap 10.3). Pipette om te mengen.
  6. Draai 30 minuten op kamertemperatuur.
  7. Wegwassen ongebonden DNA:
    1. Kortom, centrifugeren om vloeistof te verzamelen aan de onderkant van de buis (~ 2 s).
    2. Breng de buis over op een magnetisch rek. Incubeer voor ~ 2 min totdat de oplossing duidelijk is.
    3. Verwijder met de buis op magnetisch rek de supernatant.
    4. Haal de buis uit het magnetisch rek, was kralen door opnieuw uit te hangen in een 100 μL 1x B&W buffer en pipet op en neer.
    5. Breng de buis over naar het magnetisch rek. Incubeer voor ~ 2 min totdat de oplossing duidelijk is.
    6. Met buis op magnetisch rek, verwijder supernatant.
    7. Herhaal wasstappen met 100 μL LoTE (stappen 10.7.4 – 10.7.6) twee keer meer voor een totaal van 3 wasbeurten.
  8. Pcr 2 instellen zoals beschreven in tabel 1 om transposon-knooppunten te versterken en één streepjescode toe te voegen aan elk monster(tabel 2 en tabel 3).
  9. PCR 2 uitvoeren met de voorwaarden die zijn beschreven in tabel 1.
  10. Zuiver met 40 μL paramagnetische kralen (stappen 9.3.1 – 9.3.12). Elute in 17 μL water (stappen 9.3.13 – 9.3.16), verzamelen ~ 15 μL.
  11. Kwantificeer de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer. De uiteindelijke concentraties moeten ~ 50 tot 250 ng/μl zijn.
  12. Beoordeel de kwaliteit van DNA met behulp van op chips gebaseerde capillaire elektroforese(figuur 4A).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De geschetste methoden beschrijven de generatie van een high-density transposon bibliotheek in A. baumannii stam ATCC 17978 door middel van bacteriële vervoeging met behulp van E. coli MFD DAP-, die de plasmid pJNW684(figuur 4B) repliceert . Het gedetailleerde protocol maakt gebruik van bi-ouderlijke bacteriële vervoeging voor de overdracht van pJNW684 van de E. coli λpir+ donorstam naar de A. baumannii-ontvangerstam. Dit is een efficiënte en goedkope methode voor het genereren van dichte transposon mutant bibliotheken. Bacteriën werden gemengd bij geoptimaliseerde verhoudingen en paringen werden gespot op Luria-Bertani agar platen voor 1 uur (Figuur 1A). Tijdens de paring werd de transposon overgedragen van de donor naar de ontvanger stam, waar het ingevoegd in de gDNA (Figuur 1B). De paringen werden verzameld, ongeveer 105 CFU/mL werden berekend en verguld op 150 mm x 15 mm agar platen aangevuld met kanamycine. Na 14 uur groei bij 37 °C bevatten platen duizenden kolonies van verschillende grootte (figuur 1C) wat duidt op een succesvolle generatie van een transposon mutant bibliotheek. De transposon insertion mutants werden samengevoegd (Figuur 1D) en bevroren in aliquots om herhaalde vries-dooi cycli te voorkomen, die selectieve druk op de invoegbibliotheek zou kunnen toevoegen.

De gepoolde A. baumannii transposon mutant bibliotheek werd gebruikt om fitnessfactoren te identificeren die belangrijk zijn voor colistineresistentie onder subinhibitory concentraties van de antimicrobiële (Figuur 2B). De gemuteerde bibliotheek werd uitgegroeid tot logaritmische fase in de afwezigheid/aanwezigheid van 0,5 mg/L colistin in tweevoud om gemuteerde cellen uit te putten die inserties coderen in genen die bijdragen aan colistineresistentie. De totale gDNA van de resterende bibliotheekpool werd geïsoleerd van controle- en experimentele culturen en verwerkt om DNA voor te bereiden op sequencing (Figuur 3A).

Geïsoleerde gDNA werd gefragmenteerd met behulp van mechanische scheren en een poly-C staart werd toegevoegd op de DNA-fragmenten (Figuur 3A). Na de toevoeging van poly-C staart, DNA werd gezuiverd en de transposon-genoom knooppunten werden verrijkt met behulp van de poly-C specifieke primer gevolgd door een tweede ronde van PCR met behulp van een andere poly-C specifieke primer die de P7 sequencing site die nodig is voor de binding van de Illumina stroomcel en cluster generatie geïntroduceerd, en een zes-base barcode die wordt gebruikt om demultiplex bibliotheken post sequencing37,47. DNA-concentraties werden berekend en de monsters werden geanalyseerd met behulp van chip-gebaseerde capillaire elektroforese om succesvolle bibliotheek builds te bevestigen (Figuur 4A), die klaar zijn voor hoge doorvoer sequencing.

DNA-bibliotheken werden gesequenced door de volgende generatie sequencing. Een single-end, 50 cyclus run werd uitgevoerd, die 30 miljoen hoge kwaliteit leest / monster biedt 62,5-voudige dekking van de transposon bibliotheek. Transposon junctions (reads) werden in kaart gebracht met het referentiegenoom48, met behulp van commercieel verkrijgde bio-informatica analyse software. Het aantal reads op elke invoegplaats in de invoermonsters, (-) colistinecontroleconditie, werd vergeleken met het aantal reads in de uitvoermonsters, (+) colistin experimentele conditie en fitnessscores voor elke invoegplaats werden berekend. De fitnessscores werden vervolgens gegroepeerd per gen. Genen die lagere scores aantoonden toen de bibliotheek werd gekweekt in aanwezigheid van colistine ten opzichte van de inputmonsters werden beschouwd als fitnessdeterminanten voor A. baumannii survival bij subinhibitory concentraties van colistine. Zo waren transposon-invoegingen in het PmrAB-systeem met twee componenten aanwezig in het invoermonster, maar werden ze niet gevonden in het uitvoermonster. PmrAB reguleert rechtstreeks de expressie van pmrC, die fosshoethanolamine overbrengt op lipide A om de lading op het celoppervlak12,31te neutraliseren . Neutralisatie van bacteriële oppervlakte lading wordt gedacht aan de elektrostatische potentieel dat nodig is voor colistine-gemedieerde doden te verminderen. Identificatie van uitgeputte genen waarvan bekend is dat ze bijdragen aan het resistentiefenotype, gevalideerde methode.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch van transposon mutant bibliotheek bouw. aA) Bacteriële vervoeging. De "donor" stam, die codeert de omzetting machines, werd gemengd met de "ontvanger" stam. Het mengsel werd gespot op LB agar platen en toegestaan om te paren voor 1 uur (B) Generatie van transposon bibliotheek. De plasmide die de omzettingsmachine droeg werd overgebracht van de "donor" stam naar de "ontvanger" stam en de transposon werd willekeurig ingevoegd in het genoom van de "ontvanger" stam. cC) selectie. Resulterende cellen werden verguld op agar platen aangevuld met kanamycine te selecteren voor transposon inbrengen mutanten. (D) Gepoolde bibliotheek. Kolonies werden geschraapt van platen, opnieuw opgetrokken in LB en samengevoegd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Representatieve bacteriële vervoegingsresultaten en een schema van het colistin Tn-seq-experiment. (A) Representatieve kanamycine selectieplaat. De plaat is verdeeld in vijf gelijke secties. De blauwe stippen vertegenwoordigen kolonie het tellen voor schatting van A. baumannii transposon insertion mutanten. Ten minste drie afzonderlijke platen werden geteld om de uiteindelijke schatting te berekenen. (B) Identificatie van fitnessfactoren bij concentraties subinhibitory colistine. De gepoolde transposon bibliotheek werd uitgegroeid tot logaritmische groeifase, hetzij in de afwezigheid (controle) of in de aanwezigheid (experimenteel) van colistine. Zodra de culturen de juiste optische dichtheid bereikten, werden de cellen gepeld en gDNA werd geëxtraheerd uit elk monster. Elke voorwaarde werd in tweevoud getest op in totaal vier monsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Flowchart van de DNA amplicon bibliotheek gebouwd voor massale parallelle sequencing en representatieve afgeschoren gDNA. (A) Tn-seq DNA bibliotheek bouwen schematisch. Na de extractie werd gDNA gefragmenteerd via mechanische afschuifwerk. Terminal deoxynucleotidyl transferase werd gebruikt om een poly-C staart toe te voegen aan het 3'-einde van gefragmenteerd DNA voordat PCR-versterking van de transposon-genoom knooppunten en barcode toevoeging. (B) 1% agarose gel van ongehoorde en geschoren A. baumannii mutant bibliotheken na gDNA scheren stap. 1 Kb ladder werd gebruikt als een DNA-marker. Geschoren gDNA uitstrijkje varieert voornamelijk tussen ~ 100 en 500 basisparen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve kwaliteitscontrole (QC) resultaten en kaart van de plasmide die de omzettingsgenen draagt. (A) QC trace voor een DNA-bibliotheek te bouwen. Er is een piek op ~ 350 basisparen, wat wijst op succesvolle bibliotheek te bouwen. Als er wat groter DNA werd aangetroffen in de QC-resultaten, kunnen de monsters verder worden opgeruimd om grote DNA-fragmenten te verwijderen. (B) Plasmid pJNW684 bestaat uit een Himar1-mariniertransposon (groen) met een kanamycine resistance cassette (paars) voor mutantselectie, een gen dat de hyperactieve zeeman Himar1 C9 transposase (rood) onder controle van een A. baumannii 17978 specifieke promotor (blauw), een ampicilline resistentiegen(bla, oranje) en een RP4/oriT/oriR6K-voorwaardelijke oorsprong van replicatie (geel) codeert. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Reactie Setup Voorwaarden
Poly-C reactie 30 μL afgeschoren gDNA
2,5 μL van 9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP
10 μL 5X Terminal deoxynucleotidyl transferase (Tdt) reactiebuffer
1,25 μL rTdt
6,25 μL water tot 50 μL		 Incubeer op 37ºC gedurende 1 uur
PCR 1 23 μL 3'-poly-C gezuiverd DNA (hele steekproef uit vorige stap)
10 μL 10x high-fidelity DNA polymerase reactiemix
2 μL 10 mM dNTPs
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 510 biotine
3 μL 30 μM olj 376
0,5 μL high-fidelity DNA polymerase
8,5 μL zuiver water tot 50 μL totaal		 1 cyclus: 2 min 94 ºC
15 cycli: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 cyclus: 4 min 68 ºC
Wacht: ∞ 4 ºC
PCR 2 DNA-gebonden kralen van vorige stap
10 μL 10x high-fidelity DNA polymerase reactiemix
2 μL 10 mM dNTP
2 μL 50 mM MgSO4
1 μL 30 μM olj 511
1 μL 30 μM barcode primer (tabel 2)
0,5 μL high-fidelity DNA polymerase
33,5 μL zuiver water tot 50 μL		 1 cyclus: 2 min 94 ºC
15 cycli: 15 s 94 ºC
30 s 60 ºC
2 min 68 ºC
1 cyclus: 4 min 68 ºC
Wacht: ∞ 4 ºC

Tabel 1: Reactie-instelling. Opstelling en voorwaarden voor poly-C, PCR 1 en PCR 2 reacties.

Purpose Naam Volgorde
Anneals naar transposon olj510-Biotine Biotine-GATGGCCTTTTTGCGTTTCTACCTGCAGGGCGCG
Anneals naar poly-C staart olj376 olj376 olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGG
GGGGGGGGGGGGGGGGGG
Genesteld naar transposon + P5-adapter:
P5 capture site – P5 sequencing site– N5 –Tn		 olj511 olj511 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACCTTT
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGGGGACTTA
TCATCCAACCTGTTAG
Genesteld naar olj376: P7 sequencing site
– barcode XXXXXX – P7 capture site)		 Bc ## CAAGCAGAAGACGGACGAGATXXXXXXGTGA
CTGGAGTTCAGACGTGTG
zie tabel 2 voor specifieke barcodes***

Tabel 2: PCR versterking primers. PCR-versterkingsprimeren die in het protocol worden gebruikt om de transposon-knooppunten te versterken. Het doel van elk wordt vermeld in de eerste kolom.

Primer Lezen Barcode Volgorde
BC1 ATCACG (ATCACG) CGTGAT (CGTGAT) CAAGCAGAAGACGGACGAGATCGT
GATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC2 CGATGT (CGATGT) ACATCG ACATCG CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
ATCGGTGGGGAGTTCAGACGTGTG
BC3 TTAGGC TTAGGC GCCTAA GCCTAA CAAGCAGAAGACGGACGAGATGCC
TAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC4 TGACCA TGGTCA TGGTCA CAAGCAGAAGACGGACGAGATT
GGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC5 ACAGTG CACTGT (CACTGT) CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
CACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC6 GCCAAT (GCCAAT) ATTGGC CAAGCAGAAGACGGACGAGATA
TTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC7 CAGATC (CAGATC) GATCTG GATCTG CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
GATCTGGTGACTGGAGTTCGGGTGTG
BC8 ACTTGA TCAAGT TCAAGT CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
TCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC9 GATCAG GATCAG CTGATC CAAGCAGAAGACGGACGAGA
TCTGATCGTGGGGAGTTCGGGTGTG
BC10 TAGCTT AAGCta AAGCta CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
AAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC11 GGCTAC GGCTAC GTAGCC GTAGCC CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
GTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC12 CTTGTA TACAAG CAAGCAGAAGACGGACGAGATT
ACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC13 AGTCAA AGTCAA TTGACT TTGACT CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
TTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC14 AGTTCC AGTTCC GGAACT (GGAACT) CAAGCAGAAGACGGACGAGATG
GAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC15 ATGTCA TGACAT (TGACAT) CAAGCAGAAGACGGACGAGA
TTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC16 CCGTCC GGACGG GGACGG CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
GGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC17 GTAGAG GTAGAG CTCTAC CTCTAC CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
CTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC18 GTCCGC GTCCGC GCGGAC CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
GCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC19 GTGAAA GTGAAA TTTCAC TTTCAC CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
TTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC20 GTGGCC GTGGCC GGCCAC GGCCAC CAAGCAGAAGACGGACGAGATG
GCCACGTGACTGGAGTTCGTGTG
BC21 GTTTCG GTTTCG CGAAAC CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
CGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC22 CGTACG CGTACG CGTACG CGTACG CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
CGTACGGTGGGGAGTTCAGACGTGTG
BC23 GAGTGG CCACTC CAAGCAGAAGACGGACGAGATC
CACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC24 GGTAGC GGTAGC GCTACC CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
GCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC25 ACTGAT ATCAGT CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
ATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC26 ATGAGC GCTCAT GCTCAT CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
GCTCATGTGACTGGAGTTCGTGTG
BC27 ATTCCT AGGAAT (AGGAAT) CAAGCAGAAGACGGACGAGATA
GGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC28 CAAAAG CAAAAG CTTTTG CAAGCAGAAGACGGACGAGATC
TTTTGGTGGGGAGTTCAGACGTGTG
BC29 CAACTA CAACTA TAGTTG TAGTTG CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
TAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC30 CACCGG (CACCGG) CCGGTG CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
CCGGTGGGGGGAGTTCAGACGTG
BC39 CTATAC (CTATAC) GTATAG GTATAG CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
GTATAGGTGACTGGAGTTCAGACGTG
BC40 CTCAGA CTCAGA TCTGAG (TCTGAG) CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
TCTGAGGTGGGGGGAGTTCGTGTG
BC42 TAATCG TAATCG CGATTA CGATTA CAAGCAGAAGACGGACGAGATC
GATTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC43 TACAGC TACAGC GCTGTA GCTGTA CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
GCTGTAGTGACTGGAGTTCGTGTG
BC44 TATAAT TATAAT ATTATA ATTATA CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
ATTATAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC45 TCATTC TCATTC GAATGA CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
GAGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC46 TCCCGA TCCCGA TCGGGA (TCGGGA) CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
TCGGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC47 TCGAAG (TCGAAG) CTTCGA CTTCGA CAAGCAGAAGACGGACGAGATC
TTCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG
BC48 TCGGCA (TCGGCA) TGCCGA TGCCGA CAAGCAGAAGACGGACGAGAT
TGCCGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG

Tabel 3: Barcode primers. Barcode primers worden gebruikt in de tweede PCR stap om de transposon knooppunten te versterken, terwijl het toevoegen van een P7 sequencing site en barcodes aan de amplicon. Niet alle barcode primers zijn nodig om een bibliotheek te genereren. Alleen barcode primers voor het aantal monsters zijn vereist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A. baumannii is een opkomende bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid als gevolg van de snelle verwerving van AMR tegen "last-line" therapeutica, zoals colistin10,11,12,23,24,30,31. In de afgelopen decennia heeft Tn-seq een cruciale rol gespeeld bij het ophelderen van genotype-fenotype interacties tussen tal van bacteriële soorten en het uitbreiden van ons begrip van bacteriële genetica34,35,42,43. Tn-seq protocollen zijn instrumenteel geweest bij het identificeren van essentiële genen in diverse bacteriële soorten zoals Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus, de parodontale pathogene Porphyromonas gingivalis, en zelfs Mycobacterium tuberculose37,49,50,51. Naast de identificatie van essentiële genen is Tn-seq gebruikt om antibioticaresistentiegenen in Pseudomonas aeruginosate identificeren , verschillende voorwaardelijk essentiële genen in Salmonella typhimurium, en talrijke genotype-fenotyperelaties in Streptococcus pneumoniae52,53,54. Meer recent, transposon sequencing van Vibrio cholerae werd gebruikt in het baby konijn model van Cholera om genen die belangrijk zijn voor in vivo fitness tijdens infectie47te identificeren. Deze studies tonen de veelzijdigheid van Tn-seq aan omdat het kan worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo studies.

Het belangrijkste voordeel van Tn-seq ten opzichte van andere methoden, zoals microarray technologieën, 2D gel elektroforese, en qPCR, is dat het niet vereist voorkennis van het genoom of genomische informatie55. Daarom maakt transposon mutagenesis in combinatie met massief-parallelle sequencing de studie van bekende genen en genomen mogelijk, evenals de ontdekking van nieuwe genetische interacties. Hier hebben we een uitgebreide methode gepresenteerd voor het genereren van een zeer dichte transposon mutant bibliotheek in A. baumannii om factoren te identificeren die essentieel zijn voor bacteriële fitness bij blootstelling aan subinhibitory concentraties van colistine. De beschreven methode is ook met succes gebruikt in E. coli (ongepubliceerde gegevens), waaruit blijkt dat het systeem vatbaar is om Tn-seq-analyse uit te voeren bij andere gramnegatieve ziekteverwekkers, waaronder Enterobacteriaceae.

Het mariner gebruik van mariniertransposons voor insertional mutagenesis heeft verschillende voordelen. De transposon familie is ontstaan uit eukaryotische gastheren en zijn op grote schaal gebruikt om verzadigende mutant bibliotheken te genereren in diverse bacteriële populaties. Mariner transposons zijn gastheer-onafhankelijk, wat betekent dat stabiele willekeurige invoegingen kunnen worden bereikt bij afwezigheid van specifieke gastheerfactoren40,41. Bovendien hebben zeemantransposons een bepaald aantal invoeggebeurtenissen omdat ze bij voorkeur in thymine-adenine ("TA") motieven invoegen, wat de invoegbias vermindert en leidt tot robuustere statistische analyse37,56,57,58.

Verschillende op zeeherengebaseerde Tn-seq-methoden gebruiken MmeI-beperkingstering voor gDNA-fragmentatie32,42,43. Terwijl enzymatische DNA fragmentatie is een populaire en succesvolle methode, het voegt onnodige stappen aan de procedure en verhoogt potentiële bias37. Deze technieken vereisen niet alleen grote hoeveelheden uitgangsmaterialen, maar kunnen ook leiden tot ongelijke weergave van invoegopeenstellingen in downstreamanalyses37,59. Net als sommige andere methoden die niet afhankelijk zijn van MmeI nuclease activiteit52,60,61, de methode hierin is gebaseerd op mechanische scheren te fragmenteren gDNA, en TdT om een poly-C staart toe te voegen aan de 3 'einde van de DNA-fragmenten. In vergelijking met enzymatische DNA-fragmentatie en adapterligatiemethoden vereist deze aanpak aanzienlijk kleinere hoeveelheden beginnend DNA, terwijl het meer consistente resultaten oplevert, het verlaagt ook het risico op DNA-kruisbesmetting en vermindert het monsterverlies als gevolg van opsluiting in een verzegelde buis37,59,62. Bovendien levert deze methode langere, hoogwaardige sequencing-reads op van 50 nucleotiden die helpen bij een effectievere en nauwkeurigere mapping van sequenties en een robuustere downstream-analyse37,59. De toevoeging van een synthetische poly-C staart negeert mogelijke overhangen die het gevolg kunnen zijn van fragmentatie, aangezien deze methode afhankelijk is van de exogene toegevoegde poly-C-staart als herkenningsplaats voor de omgekeerde primer, die 16 dG-nucleotiden bevat aan het einde van de 3 en een sequentie die specifiek is voor de volgende generatie sequencing (bijvoorbeeld Illumina sequencing) aan het einde van 5, tot prime synthese47,59. Het gebruik van een synthetische nucleotide staart breidt de toepassing van deze methode uit op vele verschillende genomen onafhankelijk van hun oorspronkelijke inhoud59. Vervolgens worden transposon-genoomverbindingen versterkt met behulp van de poly-C specifieke primer37. Dit alternatief vereenvoudigt de procedure door het elimineren van de noodzaak van dure beperking enzymen, adapter ligatie, vorming van adapter dimers en gel zuivering stappen. We hebben het protocol verder geoptimaliseerd om efficiënt zeer verzadigde transposon insertiebibliotheken te genereren in verschillende Gram-negatieve ESKAPE-pathogenen, waaronder Acinetobacter baumannii en kunnen worden gebruikt om genetische interacties te bestuderen onder diverse in vitro en in vivo omstandigheden10.

Een beperking van Tn mutagenese is het is afhankelijk van de antibioticaresistentie markers voor de selectie. Veel Gram-negatieve ESKAPE-pathogenen zijn echter multidrugs of extensief resistent, wat betekent dat de gebruiker de resistentiecassette moet uitwisselen op basis van de specifieke ziekteverwekker van belang. Bovendien zijn sommige klinische isolaten niet vatbaar voor transposon mutagenesis met behulp van de transposon op basis van zeelieden.

Een kritieke stap van het protocol is het berekenen van het aantal Tn mutanten op plaat. Plating te veel kolonies zal resulteren in een gazon dat downstream analyse kan bemoeilijken. Als de kolonies te dichtbij of te raken zijn, kunnen ze ongewenste selectieve druk op de bibliotheek toevoegen die kan resulteren in artefacten. Idealiter zouden kolonies niet raken en gelijkmatig verdeeld over de plaat, zoals aangetoond (Figuur 2A). Omgekeerd, als er te weinig kolonies zijn verguld, zal het moeilijk zijn om meerdere Tn-invoegingen in elk gen te isoleren.

Het is ook belangrijk om de besturingselementen in stap 2.18 uit te voeren. Zoals vermeld in de nota van sectie van 3. 2, noch "donor" of "ontvanger" stam mag groeien op platen aangevuld met Ampicillin. Aangezien exogene DAP nodig is voor de groei van de "donor" stam, elke groei zou wijzen op de "ontvanger" stam repliceert pJNW684. Dit is een aanzienlijk probleem, want als de transposon niet wordt geïntegreerd in de gDNA, sequencing leest zal alleen kaart aan de plasmid, niet een integratie site. In dit geval zal het experiment waarschijnlijk geen bruikbare gegevens opleveren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door financiering van het National Institute of Health (Grant AI146829 aan J.M.B.) en wordt dankbaar erkend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM ddCTP, 2’,3’-Dideoxycytidine-5’-Triphosphate Affymetrix 77112
100 mM dCTP 2’-Deoxycytidine-5’-Triphosphate Invitrogen 10217-016
100bp DNA Ladder Molecular Weight Marker Promega PR-G2101
100mm x 15mm Petri Dishes Corning 351029
150mm x 15mm Petri Dishes Corning 351058
1X B&W N/A N/A Dilute 2X B&W by half to get 1X B&W.
2,6-Diaminopimelic acid Alfa Aesar B2239103 used at 600 µM
2X B&W N/A N/A Add 2 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
9.5 mM dCTP/0.5 mM ddCTP N/A N/A 9.5 ml 100 mM dCTP; 5 ml 10 mM ddCTP; 85.5 ml water. Store at -20°C.
AccuPrimeTM Pfx DNA Polymerase Invitrogen 12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978 ATCC N/A AmpS, KanS
Ampicillin (100 mg/L) Fisher Scientific BP1760 used at 100 mg/L
AMPure XP PCR purification system BECKMAN COULTER A63881
BioAnalyzer Agilent G2939B
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis Agilent 5067-4626
Deoxynucleotide Solution Mix (dNTP) New England Biolabs (NEB) N0447L
DynaMag-2 Magnetic rack Invitrogen 12321D
E.coli MFD Dap- N/A N/A DAP Auxotroph, requires 600 mM exogenously added DAP to grow. Contains RP4 machinery for plasmid transfer. Carrier for JNW68 (36).
Ethanol Fisher Scientific A4094
Externally Threaded Cryogenic Vials Corning 09-761-71
Glass beads Corning 72684
Glycerol Fisher Scientific G33
Inoculating loops Fisher Scientific 22-363-602 Scraping tool
Kanamycin Fisher Scientific BP906 used at 25 mg/L
LB agar, Miller Fisher Scientific BP1425
LB broth, Miller Fisher Scientific BP1426
LoTE N/A N/A Add 3 mM Tris-HCl, 0.2 mM EDTA (pH 7.5) in water. Used with Streptavidin beads. Solutions keep at room temperature.
Lysis buffer N/A N/A 9.34 mL TE buffer; 600 ml of 10% SDS; 60 ml of proteinase K (20 mg/mL)
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1 Mixture, pH 6.7/8.0, Liq.) Fisher Scientific BP1752I
Phosphate Buffered Saline, 10X Solution Fisher Scientific BP39920 Diluted to 1X
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33238
Qubit Assay Tubes Thermo Fisher Q32856
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
Sonicator with refridgerated waterbath Qsonica Sonicators Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads New England Biolabs (NEB) S1420S
TE buffer N/A N/A 10 mM Tris-HCl (pH 8.0); 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt) Promega PR-M1875

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gould, I. M., Bal, A. M. New antibiotic agents in the pipeline and how they can help overcome microbial resistance. Virulence. 4 (2), 185-191 (2013).
  2. Holzheimer, R. G. Antibiotic induced endotoxin release and clinical sepsis: a review. Journal of Chemotherapy. 13 (1), Florence, Italy. Spec No 1 159-172 (2001).
  3. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Antibiotic resistance threats in the United States, 2019. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). , (2019).
  4. Scholar, E. M., Pratt, W. B. The antimicrobial drugs. , Oxford University Press. New York. (2000).
  5. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  6. Henderson, J. C., et al. The Power of Asymmetry: Architecture and Assembly of the Gram-Negative Outer Membrane Lipid Bilayer. Annual Review of Microbiology. 70, 255-278 (2016).
  7. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83, 99-128 (2014).
  8. Raetz, C. R. H., Whitfield, C. Lipopolysaccharide Endotoxins. Annual Review of Biochemistry. 71 (1), 635-700 (2002).
  9. Kang, K. N., et al. Colistin heteroresistance in Enterobacter cloacae is regulated by PhoPQ-dependent 4-amino-4-deoxy- L -arabinose addition to lipid A. Molecular Microbiology. 111 (6), 1604-1616 (2019).
  10. Boll, J. M., et al. A penicillin-binding protein inhibits selection of colistin-resistant, lipooligosaccharide-deficient Acinetobacter baumannii. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (41), 6228-6237 (2016).
  11. Boll, J. M., et al. Reinforcing Lipid A Acylation on the Cell Surface of Acinetobacter baumannii Promotes Cationic Antimicrobial Peptide Resistance and Desiccation Survival. mBio. 6 (3), 00478 (2015).
  12. Arroyo, L. A., et al. The pmrCAB operon mediates polymyxin resistance in Acinetobacter baumannii ATCC 17978 and clinical isolates through phosphoethanolamine modification of lipid A. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (8), 3743-3751 (2011).
  13. Harris, T. L., et al. Small molecule downregulation of PmrAB reverses lipid A modification and breaks colistin resistance. ACS Chemical Biology. 9 (1), 122-127 (2014).
  14. Vaara, M. Agents that increase the permeability of the outer membrane. Microbiological Reviews. 56 (3), 395-411 (1992).
  15. Vaara, M. Polymyxins and their novel derivatives. Current Opinion in Microbiology. 13 (5), 574-581 (2010).
  16. Kassamali, Z., Rotschafer, J. C., Jones, R. N., Prince, R. A., Danziger, L. H. Polymyxins: wisdom does not always come with age. Clinical Infectious Diseases: An Official publication of the Infectious Diseases Society of America. 57 (6), 877-883 (2013).
  17. Ainsworth, G. C., Brown, A. M., Brownlee, G. Aerosporin, an antibiotic produced by Bacillus aerosporus Greer. Nature. 159 (4060), 263 (1947).
  18. Benedict, R. G., Langlykke, A. F. Antibiotic activity of Bacillus polymyxa. Journal of Bacteriology. 54 (1), 24 (1947).
  19. Stansly, P. G., Shepherd, R. G., White, H. J. Polymyxin: a new chemotherapeutic agent. Bulletin of the Johns Hopkins Hospital. 81 (1), 43-54 (1947).
  20. Hermsen, E. D., Sullivan, C. J., Rotschafer, J. C. Polymyxins: pharmacology, pharmacokinetics, pharmacodynamics, and clinical applications. Infectious Disease Clinics of North America. 17 (3), 545-562 (2003).
  21. Pedersen, M. F., Pedersen, J. F., Adsen, P. O. A clinical and experimental comparative study of sodium colistimethate and polymyxin B sulfate. Investigative Urology. 9 (3), 234-237 (1971).
  22. Falagas, M. E., Bliziotis, I. A. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the post-antibiotic era. International Journal of Antimicrobial Agents. 29 (6), 630-636 (2007).
  23. Peleg, A. Y., Seifert, H., Paterson, D. L. Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen. Clinical Microbiology Reviews. 21 (3), 538-582 (2008).
  24. Beceiro, A., Tomás, M., Bou, G. Antimicrobial resistance and virulence: a successful or deleterious association in the bacterial world. Clinical Microbiology Reviews. 26 (2), 185-230 (2013).
  25. Eliopoulos, G. M., Maragakis, L. L., Perl, T. M. Acinetobacter baumannii: Epidemiology, Antimicrobial Resistance, and Treatment Options. Clinical Infectious Diseases. 46 (8), 1254-1263 (2008).
  26. Lee, A., Nolan, A., Watson, J., Tristem, M. Identification of an ancient endogenous retrovirus, predating the divergence of the placental mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1626), 20120503 (2013).
  27. Moffatt, J. H., et al. Colistin Resistance in Acinetobacter baumannii Is Mediated by Complete Loss of Lipopolysaccharide Production. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (12), 4971-4977 (2010).
  28. Cai, Y., Chai, D., Wang, R., Liang, B., Bai, N. Colistin resistance of Acinetobacter baumannii: clinical reports, mechanisms and antimicrobial strategies. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (7), 1607-1615 (2012).
  29. Da Silva, G., Domingues, S. Interplay between Colistin Resistance, Virulence and Fitness in Acinetobacter baumannii. Antibiotics. 6 (4), 28 (2017).
  30. Chin, C. -Y., Gregg, K. A., Napier, B. A., Ernst, R. K., Weiss, D. S. A PmrB-Regulated Deacetylase Required for Lipid A Modification and Polymyxin Resistance in Acinetobacter baumannii. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7911-7914 (2015).
  31. Beceiro, A., et al. Phosphoethanolamine modification of lipid A in colistin-resistant variants of Acinetobacter baumannii mediated by the pmrAB two-component regulatory system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3370-3379 (2011).
  32. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-Wide Fitness and Genetic Interactions Determined by Tn-seq, a High-Throughput Massively Parallel Sequencing Method for Microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36, 1-24 (2015).
  33. Kwon, Y. M., Ricke, S. C., Mandal, R. K. Transposon sequencing: methods and expanding applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (1), 31-43 (2016).
  34. Yamaichi, Y., Dörr, T. Transposon Insertion Site Sequencing for Synthetic Lethal Screening. Methods in Molecular Biology. 1624, Clifton, N.J. 39-49 (2017).
  35. Goodman, A. L., et al. Identifying Genetic Determinants Needed to Establish a Human Gut Symbiont in Its Habitat. Cell Host & Microbe. 6 (3), 279-289 (2009).
  36. Wang, N., Ozer, E. A., Mandel, M. J., Hauser, A. R. Genome-Wide Identification of Acinetobacter baumannii Genes Necessary for Persistence in the Lung. mBio. 5 (3), 01163 (2014).
  37. Klein, B. A., et al. Identification of essential genes of the periodontal pathogen Porphyromonas gingivalis. BMC Genomics. 13 (1), 578 (2012).
  38. Ferrieres, L., et al. Silent Mischief: Bacteriophage Mu Insertions Contaminate Products of Escherichia coli Random Mutagenesis Performed Using Suicidal Transposon Delivery Plasmids Mobilized by Broad-Host-Range RP4 Conjugative Machinery. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6418-6427 (2010).
  39. Lim, L. M., et al. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing. Pharmacotherapy. 30 (12), 1279-1291 (2010).
  40. Lampe, D. J., Churchill, M. E., Robertson, H. M. A purified mariner transposase is sufficient to mediate transposition in vitro. The EMBO Journal. 15 (19), 5470-5479 (1996).
  41. Mazurkiewicz, P., Tang, C. M., Boone, C., Holden, D. W. Signature-tagged mutagenesis: barcoding mutants for genome-wide screens. Nature Reviews. Genetics. 7 (12), 929-939 (2006).
  42. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nature Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  43. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Reviews. Microbiology. 11 (7), 3033 (2013).
  44. Liu, H., Bouillaut, L., Sonenshein, A. L., Melville, S. B. Use of a Mariner-Based Transposon Mutagenesis System To Isolate Clostridium perfringens Mutants Deficient in Gliding Motility. Journal of Bacteriology. 195 (3), 629-636 (2013).
  45. Singer, J. T., Finnerty, W. R. Insertional specificity of transposon Tn5 in Acinetobacter sp. Journal of Bacteriology. 157 (2), 607-611 (1984).
  46. Subashchandrabose, S., et al. Acinetobacter baumannii Genes Required for Bacterial Survival during Bloodstream Infection. mSphere. 1 (1), 13-15 (2015).
  47. Shull, L. M., Camilli, A. Transposon Sequencing of Vibrio cholerae in the Infant Rabbit Model of Cholera. Vibrio Cholerae. 1839, 103-116 (2018).
  48. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes & Development. 21 (5), 601-614 (2007).
  49. Stahl, M., Stintzi, A. Identification of essential genes in C. jejuni genome highlights hyper-variable plasticity regions. Functional & Integrative Genomics. 11 (2), 241-257 (2011).
  50. Chaudhuri, R. R., et al. Comprehensive identification of essential Staphylococcus aureus genes using Transposon-Mediated Differential Hybridisation (TMDH). BMC Genomics. 10 (1), 291 (2009).
  51. Griffin, J. E., et al. High-resolution phenotypic profiling defines genes essential for mycobacterial growth and cholesterol catabolism. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002251 (2011).
  52. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. mBio. 2 (1), 00315 (2011).
  53. Khatiwara, A., et al. Genome scanning for conditionally essential genes in Salmonella enterica Serotype Typhimurium. Applied and Environmental Microbiology. 78 (9), 3098-3107 (2012).
  54. van Opijnen, T., Camilli, A. A fine scale phenotype-genotype virulence map of a bacterial pathogen. Genome Research. 22 (12), 2541-2551 (2012).
  55. Hurd, P. J., Nelson, C. J. Advantages of next-generation sequencing versus the microarray in epigenetic research. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (3), 174-183 (2009).
  56. Barquist, L., Boinett, C. J., Cain, A. K. Approaches to querying bacterial genomes with transposon-insertion sequencing. RNA Biology. 10 (7), 1161-1169 (2013).
  57. Perry, B. J., Yost, C. K. Construction of a mariner-based transposon vector for use in insertion sequence mutagenesis in selected members of the Rhizobiaceae. BMC Microbiology. 14 (1), 298 (2014).
  58. Plasterk, R. H. A., Izsvák, Z., Ivics, Z. Resident aliens: the Tc1/ mariner superfamily of transposable elements. Trends in Genetics. 15 (8), 326-332 (1999).
  59. Lazinski, D. W., Camilli, A. Homopolymer tail-mediated ligation PCR: a streamlined and highly efficient method for DNA cloning and library construction. BioTechniques. 54 (1), (2013).
  60. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  61. Langridge, G. C., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  62. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved Protocols for the Illumina Genome Analyzer Sequencing System. Current Protocols in Human Genetics. 62 (1), (2009).

Tags

Biologie transposon high-throughput sequencing Gram-negatief Acinetobacter baumannii colistin ESKAPE
Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll,… More

Kazi, M. I., Schargel, R. D., Boll, J. M. Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (161), e61612, doi:10.3791/61612 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter