JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

توليد وتجميع النوى الخاصة بالفيروسات من الفيروسات المتزامنة التنفسية

Published: July 27, 2021
doi:
10.3791/62010
, , , ,
1Department of Biochemistry,Emory University School of Medicine

Summary

للتحليل الميكانيكي المتعمق للفيروس التزامني التنفسي (RSV) تخليق الحمض النووي الريبي ، نبلغ عن بروتوكول لاستخدام فوسفوبروتين الفوسفورتين المرافق (P) للكوادر الخالية من الحمض النووي الريبي (N0)للتجميع المختبري اللاحق للنيوكليوكابسيدات الخاصة بالفيروس (NCs).

Abstract

استخدام قالب الحمض النووي الريبي أصيلة أمر بالغ الأهمية لتعزيز المعرفة الأساسية لتوليف الحمض النووي الريبي الفيروسية التي يمكن أن توجه كل من اكتشاف ميكانيكي وتطوير المقايسة في علم الفيروسات. إن نموذج الحمض النووي الريبي لفيروسات الحمض النووي الريبي غير المخلوقة (NNS) من فيروسات الحمض النووي الريبي (NNS)، مثل فيروس التزامن التنفسي (RSV)، ليس جزيء الحمض النووي الريبي وحده، بل هو مركب الريبونوكليوبروتين (N) المنقوع. على الرغم من أهمية قالب الحمض النووي الريبي الأصيل ، فإن توليد وتجميع مثل هذا المجمع ريبونوكليوبوبروتين لا تزال متطورة وتتطلب توضيحا متعمقا. التحدي الرئيسي هو أن RSV N مفرط التعبير يربط بشكل غير محدد بالرنانات الخلوية لتشكيل جزيئات عشوائية تشبه النيوكليوكابسيد (NCLPs). هنا، أنشأنا بروتوكولا للحصول على N خالية من الحمض النووي الريبي (N0)أولا من خلال المشاركة في التعبير N مع فوسفوبروتين مرافق (P)، ثم تجميع N0 مع أوليغوس الحمض النووي الريبي مع تسلسل الحمض النووي الريبي RSV محددة للحصول على نواة خاصة بالفيروسات (NCs). يوضح هذا البروتوكول كيفية التغلب على صعوبة في إعداد هذا المعقد ribonucleoprotein الفيروسية الصعبة تقليديا.

Introduction

غير الفئات السلبية الشعور (NNS) فيروسات الحمض النووي الريبي تشمل العديد من مسببات الأمراض البشرية الهامة، مثل داء الكلب، والإيبولا، وفيروس التزامن التنفسي (RSV)1،2. RSV هو السبب الرئيسي لأمراض الجهاز التنفسي مثل التهاب القصيبات والالتهاب الرئوي في الأطفال الصغار وكبار السن في جميع أنحاء العالم3. حاليا، لا توجد لقاحات فعالة أو علاجات مضادة للفيروسات المتاحة لمنع أو علاج RSV4. كجزء من دورة الحياة، يعمل جينوم RSV كنموذج للنسخ المتماثل من قبل بوليمرات الحمض النووي الريبي التابع ل RSV لإنتاج مستضد، والذي بدوره يعمل كنموذج لتوليد جينوم ذري. يتم كذلك تحلل كل من الجينوم والرنانات المضادة للجينوم بالكامل بواسطة النوى (N) لتشكيل النيوكليوكابسيدات (NCs)3. لأن NCs بمثابة قوالب لكل من النسخ المتماثل والنسخ من قبل بوليمراز RSV، التجمع NC السليم أمر بالغ الأهمية للبوليميراز للوصول إلى قوالب لتخليق الحمض النووي الريبي5. ومن المثير للاهتمام، استنادا إلى التحليلات الهيكلية للبوليميرا الفيروسية NNS، فمن المفترض أن العديد من البروتينات N ينفصم عابرا من NCs للسماح بالوصول إلى البوليميراز وإعادة ربط إلى الجيش الملكي النيبالي بعد تخليق الحمض النووي الريبي6،7،8،9،10،12.

حاليا، وقد أنشئت RSV الحمض النووي الريبي البلمرة المقايسة باستخدام البوليمرات RSV تنقية على قوالب الجيش الملكي النيبالي عارية قصيرة13،14. ومع ذلك، فإن أنشطة البوليميراز RSV لا تصل إلى المستوى الأمثل، كما لوحظ في المنتجات غير المعالجة والإجهاضية التي تولدها بوليمرات RSV عند استخدام قوالب الحمض النووي الريبي العارية. عدم وجود NC مع الحمض النووي الريبي فيروس محددة هو الحاجز الرئيسي لمزيد من الفهم الآلي لتوليف الحمض النووي الريبي RSV. ولذلك، باستخدام قالب الحمض النووي الريبي أصيلة يصبح حاجة ماسة لتعزيز المعرفة الأساسية من تخليق الحمض النووي الريبي RSV. الهياكل المعروفة للجسيمات الشبيهة بالنيوكليوكابسيد (NCLPs) من RSV وغيرها من فيروسات الحمض النووي الريبي NNS تكشف عن أن الحمض النووي الريبي في NCLPs هي إما الحمض النووي الريبي الخلوي العشوائي أو متوسط الحمض النووي الريبي الجينومي الفيروسي15،16،17،18،19. معا، العقبة الرئيسية هي أن N يربط بشكل غير محدد إلى RNAs الخلوية لتشكيل NCLPs عندما يتم التعبير عن N في الخلايا المضيفة.

للتغلب على هذه العقبة، أنشأنا بروتوكولا للحصول على RNA خالية (N0)أولا وتجميع N0 مع الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسية الأصيلة في NCLPs20. مبدأ هذا البروتوكول هو الحصول على كمية كبيرة من N RNA خالية من المؤتلف (N0)من خلال التعبير المشترك N مع مرافق, المجال N-محطة من فوسفوبروتين RSV (PNTD). يمكن تحفيز N0P المنقى وتجميعه في NCLPs عن طريق إضافة أوليغوس الحمض النووي الريبي الخاص ب RSV ، وخلال عملية التجميع ، يتم إزاحة المرافق PNTD عند إضافة أوليغوس الحمض النووي الريبي.

هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لتوليد وتجميع NCs RSV RNA محددة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف الاستنساخ الجزيئي، وإعداد البروتين، والتجميع في المختبر، والتحقق من صحة التجميع المعقد. ونسلط الضوء على استراتيجية الاستنساخ لتوليد بنى ثنائية السيسترونيك للكراز المشترك للبروتين للاستنساخ الجزيئي. لإعداد البروتين، ونحن نصف إجراءات زراعة الخلايا، واستخراج البروتين، وتنقية مجمع البروتين. ثم نناقش طريقة التجميع في المختبر من NCs RSV RNA محددة. وأخيرا، نستخدم كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) والمجهر الإلكتروني السلبي للبقع (EM) لتوصيف وتصور NCLPs المجمعة.

Protocol

1. الاستنساخ الجزيئي ملاحظة: تم استخدام ليجاس الاستنساخ المستقل (LIC) لجعل RSV ثنائي cistronic coexpression بناء البلازميد. LIC هو أسلوب وضعت في أوائل 1990s، والذي يستخدم النشاط إكسو 3′-5 ‘من بوليمرات الحمض النووي T4 لخلق يتدلى مع التكامل بين ناقلات وإدراج الحمض النووي21،</…

Representative Results

تنقية بروتين N0P الخالي من الحمض النووي الريبيمع هذا البروتوكول، يمكن الحصول على مركب RSV N0P القابل للذوبان على نطاق واسع. تم التعبير عن الطول الكامل للجزء N و N النهائي من بروتينات P مع 10X His-Tag على بروتين N في الإشريكية القولونية. تم تنقية N0P باستخدام عمود الكوب?…

Discussion

الجسيمات المعروفة الشبيهة بالنيوكليوكابسيد (NCLP) هياكل غير المقوسة السلبية الشعور (NNS) فيروسات الحمض النووي الريبي تبين أن NCLPs تجميعها هي N معقدة مع الحمض النووي الريبي الخلوي المضيف عندما مفرط في التعبير في أنظمة التعبير البكتيرية أو eukaryotic15,16,<sup class="xref…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويدعم البرامج البحثية في مختبر ليانغ في إيموري المعهد الوطني الأمريكي للعلوم الطبية العامة (NIGMS)، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة R01GM130950، وصندوق بدء البحث في كلية الطب بجامعة إيموري. ويعترف صاحب البلاغ بأعضاء مختبر ليانغ للدعم المفيد والمناقشة النقدية.

Materials

Agarose SIgma A9539-500G making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore UFC901024 concentrate the protein sample
Ampicillin sodium GOLD BIOTECHNOLOGY 5118.111317A antibiotic for cell culture
AseI NEB R0526S making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads Gold Bio H-310-500 For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater CORNING 6885-DB Heate the sample
dCTP Invitrogen 10217016 making construct using LIC method
dGTP Invitrogen 10218014 making construct using LIC method
Glycerol Sigma G5516-4L making solution
HEPES Sigma H3375-100G making solution
HiTrap Q HP Sigma GE29-0513-25 Protein purification
Imidazole Sigma I5513-100G making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) GOLD BIOTECHNOLOGY 1116.071717A induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes VWR 47730-598 for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor SpectraLab MSX-XL-2020 sonicator for lysing cell
Negative stain grids Electron Microscopy Sciences CF400-Cu-TH For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R eppendorf M1282-0000 Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385-1L making solution
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480L PCR
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 Purify DNA
SSPI-HF NEB R3132S making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL Sigma GE29-0915-96 Protein purification
T4 DNA polymerase Sigma 70099-3 making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge Fisher Scientific 36-101-0816 Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride Sigma T3253-250G making solution
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22451 making negative stain solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
  2. Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
  3. Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
  4. Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
  5. Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
  6. Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
  7. Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
  8. Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
  9. Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
  10. Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
  11. Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
  12. Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
  13. Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
  14. Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
  15. Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
  16. Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
  17. Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
  18. Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
  19. Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
  20. Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
  21. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  22. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  23. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  24. Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
  25. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  26. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
  27. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
  28. Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
  29. Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
  30. Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
  31. Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
  32. Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
  33. Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
  34. Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).

Tags

Keywords: Virus-specific NucleocapsidsRespiratory Syncytial VirusRecombinant Viral Protein ExpressionRNA-free N ProteinLigation Independent CloningElectron MicroscopyBi-cistronic ConstructionProtein ExpressionChromatographyCobalt Gravity ColumnQ ColumnHPLCUV Detection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gao, Y., Ogilvie, C., Raghavan, A., Von Hoffmann, C., Liang, B. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (173), e62010, doi:10.3791/62010 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image