Geração e montagem de nucleocapsídeos específicos do vírus do vírus sincicial respiratório

Summary

Para uma análise mecanicista aprofundada da síntese de RNA do vírus sincicial respiratório (RSV), relatamos um protocolo de utilização da fosfoproteína acompanhante (P) para coexpressão da nucleoproteína livre de RNA (N⁰) para posterior montagem in vitro dos nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs).

Abstract

O uso de um modelo de RNA autêntico é fundamental para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA viral que pode guiar tanto a descoberta mecanicista quanto o desenvolvimento de ensaios em virologia. O modelo de RNA de vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS), como o vírus sincicial respiratório (RSV), não é apenas uma molécula de RNA, mas sim um complexo de ribonucleoproteína encapsidada por nucleoproteína. Apesar da importância do autêntico modelo de RNA, a geração e montagem de tal complexo ribonucleoproteína permanecem sofisticadas e requerem elucidação aprofundada. O principal desafio é que o RSV N superexpresso liga-se não especificamente às RNAs celulares para formar partículas aleatórias semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs). Aqui, estabelecemos um protocolo para obter N (N⁰⁾livre de RNA primeiro, co-expressando N com uma fosfoproteína acompanhante (P), depois montando n⁰ com oligos de RNA com a sequência de RNA específica do RSV para obter nucleocapsídeos específicos do vírus (NCs). Este protocolo mostra como superar a dificuldade na preparação desse complexo tradicionalmente desafiador de ribonucleoproteína viral.

Introduction

Os vírus de RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) incluem muitos patógenos humanos significativos, como raiva, Ebola e vírus sincicial respiratório (RSV)^1,2. O RSV é a principal causa de doenças respiratórias, como bronquiolite e pneumonia em crianças pequenas e idosos em todo o mundo³. Atualmente, não há vacinas efetivas ou terapias antivirais disponíveis para prevenir ou tratar o RSV⁴. Como parte do ciclo de vida, o genoma RSV serve como modelo para replicação pela polimerase RNA dependente do RSV RNA para produzir um antígeno, que por sua vez atua como modelo para gerar um genoma descendente. Tanto o genoma quanto o antígeno RNAs são inteiramente encapsidados pela nucleoproteína (N) para formar os nucleocapsídeos (NCs)³. Como os NCs servem como modelos para replicação e transcrição pela polimerase RSV, o conjunto NC adequado é crucial para que a polimerase tenha acesso aos modelos para síntese de RNA⁵. Curiosamente, com base nas análises estruturais das polmerases virais NNS, hipótese-se que várias proteínas N se dissociam transitoriamente das NCs para permitir o acesso da polimerase e rebinadas ao RNA após a síntese do RNA^{6,7,8,9,10,11,12}.

Atualmente, o ensaio de polimerização RSV RNA foi estabelecido utilizando polimerase RSV purificada em modelos de RNA nus curtos^13,14. No entanto, as atividades da polimerase RSV não alcançam o ideal, como observado nos produtos não processivos e abortivos gerados pela polimerase RSV ao usar modelos de RNA nus. A falta de NC com RNA específico do vírus é uma barreira primária para a compreensão mecanicista da síntese do RSV RNA. Portanto, o uso de um modelo de RNA autêntico torna-se uma necessidade crítica para avançar no conhecimento fundamental da síntese de RNA RSV. As estruturas conhecidas das partículas semelhantes a nucleocapsídeos (NCLPs) do RSV e de outros vírus NNS RNA revelam que os RNAs nos NCLPs são RNAs celulares aleatórios ou RNAs genômicas virais^{médias 15,16,17,18,19}. Juntos, o principal obstáculo é que N liga não especificamente aos RNAs celulares para formar NCLPs quando n é superexpresso nas células host.

Para superar esse obstáculo, estabelecemos um protocolo para obter o RNA sem RNA (N⁰) primeiro e montar o N⁰ com RNA genômico viral autêntico em NCLPs²⁰. O princípio deste protocolo é obter uma grande quantidade de N (N) recombinante livre de RNA (N⁰⁾co-expressando N com um acompanhante, o domínio n-terminal de fosfoproteína RSV (P_NTD). O N⁰P purificado poderia ser estimulado e montado em NCLPs adicionando oligos RNA específicos do RSV, e durante o processo de montagem, o acompanhante P_NTD é deslocado após a adição de oligos RNA.

Aqui, detalhamos um protocolo para a geração e montagem de NCs específicos do RSV RNA. Neste protocolo, descrevemos a clonagem molecular, preparação de proteínas, montagem in vitro e validação da montagem complexa. Destacamos a estratégia de clonagem para gerar construções bi-cistrônicas para coexpressão de proteínas para clonagem molecular. Para a preparação de proteínas, descrevemos os procedimentos da cultura celular, extração de proteínas e a purificação do complexo proteico. Em seguida, discutimos o método de montagem in vitro dos NCs específicos do RSV RNA. Finalmente, usamos cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e microscopia eletrônica de manchas negativas (EM) para caracterizar e visualizar os NCLPs montados.

Protocol

1. Clonagem molecular NOTA: A Clonagem Independente de Ligase (LIC) foi usada para fazer um plasmídeo de coexpressão bi-cistronic RSV. LIC é um método desenvolvido no início da década de 1990, que utiliza a atividade Exo 3′-5′ da polimerase de DNA T4 para criar saliências com complementaridade entre o vetor e a inserção de DNA21,22. As construções foram feitas utilizando-se o DNA vetorial 2BT-10, que consiste …

Representative Results

Purificação da proteína N0P livre de RNACom este protocolo, um complexo solúvel solúvel RSV N0P pode ser obtido em larga escala. A extensão total da parte terminal N e N das proteínas P foi co-expressa com 10X His-Tag na proteína N em E. coli. N0P foi purificado usando uma coluna de cobalto, troca de íons e cromatografia de exclusão de tamanho. O N0P contém o terminal N e N de comprimento completo P, mas não continha RNA celular baseado…

Discussion

As conhecidas estruturas de partículas nucleocárides (NCLP) dos vírus RNA de sentido negativo não-esegmentado (NNS) mostram que os NCLPs montados são o complexo N com RNAs celulares hospedeiros quando superexpressos em sistemas de expressão bacteriana ou eucariótica^{15,16,17,18,19}. Estudos anteriores tentaram obter o RNA free N com uma variedade de méto…

Materials

Agarose	SIgma	A9539-500G	making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore	UFC901024	concentrate the protein sample
Ampicillin sodium	GOLD BIOTECHNOLOGY	5118.111317A	antibiotic for cell culture
AseI	NEB	R0526S	making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads	Gold Bio	H-310-500	For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater	CORNING	6885-DB	Heate the sample
dCTP	Invitrogen	10217016	making construct using LIC method
dGTP	Invitrogen	10218014	making construct using LIC method
Glycerol	Sigma	G5516-4L	making solution
HEPES	Sigma	H3375-100G	making solution
HiTrap Q HP	Sigma	GE29-0513-25	Protein purification
Imidazole	Sigma	I5513-100G	making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)	GOLD BIOTECHNOLOGY	1116.071717A	induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes	VWR	47730-598	for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor	SpectraLab	MSX-XL-2020	sonicator for lysing cell
Negative stain grids	Electron Microscopy Sciences	CF400-Cu-TH	For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R	eppendorf	M1282-0000	Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute	Sigma	74385-1L	making solution
OneTaq DNA Polymerase	NEB	M0480L	PCR
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28706	Purify DNA
SSPI-HF	NEB	R3132S	making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL	Sigma	GE29-0915-96	Protein purification
T4 DNA polymerase	Sigma	70099-3	making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Fisher Scientific	36-101-0816	Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride	Sigma	T3253-250G	making solution
Uranyl Formate	Electron Microscopy Sciences	22451	making negative stain solution