יצירה והרכבה של נוקלאוקפסידים ספציפיים לווירוסים של הנגיף הסינכרוני הנשימתי
Summary
לניתוח מכני מעמיק של סינתזת RNA של הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אנו מדווחים על פרוטוקול של ניצול הפוספופרוטאין המלווה (P) לצורך דו-קיום של הנוקליאופרוטאין (N0)נטול ה- RNA להרכבה במבחנה של הגרעינים הספציפיים לנגיף (NCs).
Abstract
השימוש בתבנית RNA אותנטית הוא קריטי כדי לקדם את הידע הבסיסי של סינתזת RNA ויראלית שיכולה להנחות הן גילוי מכני והן פיתוח מבחנים בוירולוגיה. תבנית ה- RNA של וירוסי RNA שליליים (NNS) שאינם מוגנים, כגון הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אינה מולקולת RNA בלבד אלא קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין עטוף נוקלאופרטאין (N). למרות החשיבות של תבנית RNA אותנטית, הדור וההרכבה של קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין כזה נשארים מתוחכמים ודורשים הבהרת עומק. האתגר העיקרי הוא כי N RSV overexpressed נקשר באופן לא ספציפי RNAs הסלולר כדי ליצור חלקיקים אקראיים דמויי nucleocapsid (NCLPs). כאן, הקמנו פרוטוקול כדי להשיג N ללא RNA (N0)תחילה על ידי שיתוף הבעה N עם phosphoprotein מלווה (P), ולאחר מכן הרכבת N0 עם אוליגוס RNA עם רצף RNA ספציפי RSV כדי להשיג נוקליקופסידים ספציפיים לנגיף (NCs). פרוטוקול זה מראה כיצד להתגבר על הקושי בהכנת מתחם ריבונוקלאופרוטאין ויראלי מאתגר באופן מסורתי.
Introduction
וירוסי RNA שליליים (NNS) שאינם מוגנים כוללים פתוגנים אנושיים משמעותיים רבים, כגון כלבת, אבולה ווירוס סינסיטיאלי נשימתי (RSV)1,2. RSV הוא הגורם המוביל למחלות בדרכי הנשימה כגון ברונכיוליטיס ודלקת ריאות אצל ילדים צעירים ומבוגרים ברחבי העולם3. נכון לעכשיו, אין חיסונים יעילים או טיפולים אנטי ויראליים זמינים כדי למנוע או לטפל RSV4. כחלק ממחזור החיים, הגנום RSV משמש כתבנית לשכפול על ידי פולימראז RNA תלוי RSV לייצר אנטיגנום, אשר בתורו פועל כתבנית כדי ליצור גנום צאצאים. הן הגנום והן האנטיגנום RNAs הם עטופים לחלוטין על ידי נוקלאופרוטין (N) כדי ליצור את nucleocapsids (NCs)3. מכיוון שה- NCs משמשים כתבניות הן עבור שכפול והן עבור שעתוק על-ידי פולימראז RSV, הרכבת NC נכונה חיונית עבור הפולימראז כדי לקבל גישה לתבניות עבור סינתזת RNA5. מעניין, בהתבסס על ניתוחים מבניים של פולימראז נגיפי NNS, הוא שיערו כי מספר חלבוני N להתיר באופן חולף מן NCs כדי לאפשר את הגישה של פולימראז rebind ל- RNA לאחר סינתזת RNA6,7,8,9,10,11,12.
נכון לעכשיו, מבחני פולמור RNA RSV הוקמה באמצעות פולימראז RSV מטוהר על תבניות RNA עירום קצר13,14. עם זאת, הפעילויות של פולימראז RSV אינן מגיעות אופטימלית, כפי שנצפה במוצרים שאינם מעובדים וביטול שנוצר על ידי פולימראז RSV בעת שימוש בתבניות RNA עירום. חוסר NC עם RNA ספציפי לנגיף הוא מחסום עיקרי להבנה מכנית נוספת של סינתזת RNA RSV. לכן, שימוש בתבנית RNA אותנטית הופך לצורך קריטי כדי לקדם את הידע הבסיסי של סינתזת RNA RSV. המבנים הידועים של חלקיקים דמויי nucleocapsid (NCLPs) מ RSV ווירוסי RNA NNS אחרים מגלים כי RNAs ב- NCLPs הם או RNAs הסלולר אקראי או ממוצע RNAs גנומי ויראלי15,16,17,18,19. יחד, המשוכה העיקרית היא ש- N נקשר באופן לא ספציפי ל- RNAs סלולריים כדי ליצור NCLP כאשר N מתרשם יתר על ה- 0 בתאים המארחים.
כדי להתגבר על משוכה זו, הקמנו פרוטוקול כדי להשיג RNA חינם (N0)הראשון להרכיב N0 עם RNA גנומי ויראלי אותנטי לתוך NCLPs20. העיקרון של פרוטוקול זה הוא להשיג כמות גדולה של N ללא רנ”א רקומביננטי (N0)על ידי שיתוף להביע N עם מלווה, תחום N-מסוף של RSV פוספופרוטאין (PNTD). N0P מטוהר יכול להיות מגורה והרכיב לתוך NCLPs על ידי הוספת אוליגוס RNA ספציפי RSV, ובמהלך תהליך ההרכבה, המלווה PNTD נעקר על תוספת של אוליגוס RNA.
כאן, אנו מפרטים פרוטוקול עבור הדור וההרכבה של NCs ספציפיים RNA RSV. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השיבוט המולקולרי, הכנת החלבון, הרכבת במבחנה ואימות ההרכבה המורכבת. אנו מדגישים את אסטרטגיית השיבוט כדי ליצור מבנים דו-סיסטרוניים לדו-קיום חלבונים לשיבוט מולקולרי. להכנת חלבונים, אנו מתארים את ההליכים של תרבית התא, מיצוי החלבון וטיהור קומפלקס החלבון. לאחר מכן אנו דנים בשיטה להרכבה במבחנה של NCs ספציפיים RNA RSV. לבסוף, אנו משתמשים כרומטוגרפיה אי-הכללת גודל (SEC) ומיקרוסקופ אלקטרוני כתם שלילי (EM) כדי לאפיין לדמיין ותמחה את NCLPs התאספו.
Protocol
Representative Results
Discussion
המבנים הידועים דמויי nucleocapsid חלקיקים (NCLP) של וירוסי RNA שליליים (NNS) ללא סגמנטים מראים כי NCLPs התאספו הם N מורכב עם RNAs הסלולר המארח כאשר overexpressed במערכות ביטוי חיידקי או אוקריוטי15,16,17,18,19. מחקרים קודמים ניסו ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תוכניות המחקר במעבדת ליאנג באמורי נתמכות על ידי המכון הלאומי האמריקאי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת מספר הפרס R01GM130950, וקרן הסטארט-אפ למחקר בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי. המחבר מכיר בחברי מעבדת ליאנג לתמיכה מועילה ודיון ביקורתי.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
