Generazione e assemblaggio di nucleocapsidi specifici del virus respiratorio
Summary
Per un’analisi meccanicistica approfondita della sintesi dell’RNA del virus respiratorio sincrezionale (RSV), segnalamo un protocollo di utilizzo della fosfoproteina chaperone (P) per la coespressione della nucleoproteina priva di RNA (N0)per il successivo assemblaggio in vitro dei nucleocapsidi specifici del virus (NC).
Abstract
L’uso di un autentico modello di RNA è fondamentale per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell’RNA virale che può guidare sia la scoperta meccanicistica che lo sviluppo di saggi in virologia. Il modello di RNA dei virus dell’RNA a senso negativo non commentati (NNS), come il virus respiratorio sincrezionale (RSV), non è una molecola di RNA da sola ma piuttosto un complesso di ribonucleoproteina encapsidata di nucleoproteina (N). Nonostante l’importanza dell’autentico modello di RNA, la generazione e l’assemblaggio di un tale complesso di ribonucleoproteina rimangono sofisticati e richiedono una spiegazione approfondita. La sfida principale è che l’RSV N sovraespresso si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare particelle casuali simili a nucleocapside (NCLP). Qui, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere N (N0)privo di RNA prima co-esprimendo N con una fosfoproteina chaperone (P), quindi assemblando N0 con oligo di RNA con la sequenza di RNA specifica della RSV per ottenere nucleocapsidi specifici del virus (NC). Questo protocollo mostra come superare la difficoltà nella preparazione di questo complesso di ribonucleoproteina virale tradizionalmente impegnativo.
Introduction
I virus dell’RNA a senso negativo (NNS) non commentati includono molti agenti patogeni umani significativi, come rabbia, Ebola e virus respiratorio sincrezionale (RSV)1,2. Rsv è la principale causa di malattie respiratorie come bronchiolite e polmonite nei bambini piccoli e negli adulti più grandi in tutto ilmondo 3. Attualmente, non sono disponibili vaccini efficaci o terapie antivirali per prevenire o trattare RSV4. Come parte del ciclo di vita, il genoma RSV funge da modello per la replicazione da parte dell’RNA polimerasi dipendente dall’RNA RSV per produrre un antigenoma, che a sua volta funge da modello per generare un genoma di progenie. Sia il genoma che l’antigenoma RNA sono interamente racchiusi dalla nucleoproteina (N) per formare i nucleocapsidi (NC)3. Poiché gli NC fungono da modelli sia per la replicazione che per la trascrizione da parte della RSV polimerasi, un adeguato assemblaggio NC è fondamentale affinché la polimerasi ottenga l’accesso ai modelli per la sintesi dell’RNA5. È interessante notare che, sulla base delle analisi strutturali delle polimerasi virali NNS, si ipotizza che diverse N proteine si dissociano transitoriamente dagli NC per consentire l’accesso della polimerasi e ricombinate all’RNA dopo la sintesi dell’RNA6,7,8,9,10,11,12.
Attualmente, il test di polimerizzazione dell’RNA RSV è stato stabilito utilizzando polimerasi RSV purificata su brevi modelli di RNAnudo 13,14. Tuttavia, le attività della RSV polimerasi non raggiungono ottimale, come osservato nei prodotti non processivi e abortivi generati dalla RSV polimerasi quando si utilizzano modelli di RNA nudi. La mancanza di NC con RNA specifico del virus è una barriera primaria per l’ulteriore comprensione meccanicistica della sintesi dell’RNA RSV. Pertanto, l’utilizzo di un autentico modello di RNA diventa un’esigenza critica per far progredire la conoscenza fondamentale della sintesi dell’RNA RSV. Le strutture note delle particelle nucleocapside-simili (NCLP) da RSV e altri virus NNS RNA rivelano che gli RNA negli NCLP sono RNA cellulari casuali o RNA genomiche virali medie15,16,17,18,19. Insieme, l’ostacolo principale è che N si lega non specificamente agli RNA cellulari per formare NCLP quando N è sovraespresso nelle celle ospiti.
Per superare questo ostacolo, abbiamo stabilito un protocollo per ottenere prima RNA-free (N0) e assemblare N0 con autentico RNA genomico virale in NCLP20. Il principio di questo protocollo è quello di ottenere una grande quantità di N (N 0) ricombinare n (N0)co-esprimere N con un chaperone, il dominio N-terminale della fosfoproteina RSV (PNTD). L’N0P purificato potrebbe essere stimolato e assemblato in NCLP aggiungendo oligo di RNA specifici per RSV, e durante il processo di assemblaggio, il chaperone PNTD viene spostato dopo l’aggiunta di oligo di RNA.
Qui, dettagliamo un protocollo per la generazione e l’assemblaggio di NC specifici dell’RNA RSV. In questo protocollo, descriviamo la clonazione molecolare, la preparazione proteica, l’assemblaggio in vitro e la convalida dell’assemblaggio complesso. Evidenziamo la strategia di clonazione per generare costrutti bi-cistronici per la coespressione proteica per la clonazione molecolare. Per la preparazione delle proteine, descriviamo le procedure di coltura cellulare, estrazione proteica e purificazione del complesso proteico. Quindi discutiamo il metodo per l’assemblaggio in vitro degli NC specifici dell’RNA RSV. Infine, utilizziamo la cromatografia ad esclusione di dimensione (SEC) e la microscopia elettronica a macchia negativa (EM) per caratterizzare e visualizzare gli NCLP assemblati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le strutture note di particelle nucleocapside-simili (NCLP) dei virus RNA a senso negativo non commentati (NNS) mostrano che gli NLP assemblati sono il complesso N con RNA cellulari ospiti quando sovraespresso nei sistemi di espressione batterica o eucariotica15,16,17,18,19. Studi precedenti hanno tentato di ottenere l’N privo di RNA con una varietà di metodi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I programmi di ricerca nel laboratorio Liang di Emory sono supportati dal National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) degli Stati Uniti, dal National Institutes of Health (NIH) con il numero di premio R01GM130950 e dal Research Start-Up Fund presso la Emory University School of Medicine. L’autore riconosce i membri del laboratorio Liang per il supporto utile e la discussione critica.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
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