Solunum Sinsitial Virüsünün Virüse Özgü Nükleopapsidlerinin Üretimi ve Montajı
Summary
Solunum sinsitial virüsünün (RSV) RNA sentezinin derinlemesine mekanistik analizi için, virüse özgü nükleokapsidlerin (NC) sonraki in vitro montajı için RNA içermeyen nükleoproteinin (N0)birlikte ifade edilmesi için refakatçi fosfoprotein (P) kullanma protokolünü rapor ediyoruz.
Abstract
Özgün bir RNA şablonunun kullanımı, virolojide hem mekanistik keşif hem de tahlil gelişimine rehberlik edebilecek viral RNA sentezinin temel bilgisini ilerletmek için kritik öneme sahiptir. Solunum sinsitial virüsü (RSV) gibi nonsegmented negatif duyu (NNS) RNA virüslerinin RNA şablonu, tek başına bir RNA molekülü değil, nükleoprotein (N) kapsüllenmiş ribonikötoprotein kompleksidir. Otantik RNA şablonunun önemine rağmen, böyle bir ribonükleoprotein kompleksinin üretimi ve montajı sofistike kalır ve derinlemesine aydınlatma gerektirir. Asıl zorluk, aşırı ifade edilen RSV N’nin rastgele nükleocapsid benzeri parçacıklar (NCLP’ler) oluşturmak için özellikle hücresel RNA’lara bağlanmamasıdır. Burada, önce N’yi bir refakatçi fosfoprotein (P) ile birlikte ifade ederek RNA içermeyen N (N0)elde etmek için bir protokol oluşturduk, daha sonra virüse özgü nükleokapsidler (NC’ ler) elde etmek için RSV’ye özgü RNA dizisi ile RNA oligos ile N0’ı birleştirdik. Bu protokol, geleneksel olarak zorlu olan bu viral riboniklioprotein kompleksinin hazırlanmasındaki zorluğun nasıl üstesinden gelindiğini göstermektedir.
Introduction
Nonsegmented negatif duyu (NNS) RNA virüsleri kuduz, Ebola ve solunum senksiyal virüs (RSV)1,2gibi birçok önemli insan patojenini içerir. RSV, dünya çapında küçük çocuklarda ve yaşlı yetişkinlerde bronşiolit ve zatürre gibi solunum yolu hastalıklarının önde gelen nedenidir3. Şu anda, RSV4’üönlemek veya tedavi etmek için etkili bir aşı veya antiviral tedavi bulunmamaktadır. Yaşam döngüsünün bir parçası olarak, RSV genomu, RSV RNA bağımlı RNA polimerazının bir antigenom üretmek için çoğaltma şablonu olarak hizmet eder ve bu da bir soy genomu oluşturmak için şablon görevi görür. Hem genom hem de antigenom RNA’ları, nükleocapsidleri (NC’ ler) oluşturmak için tamamen nükleoprotein (N) tarafından kapsüllenir3. NC’ler RSV polimeraz tarafından hem çoğaltma hem de transkripsiyon için şablonlar olarak hizmet verdiğinden, polimerazın RNA sentezi 5 şablonlarına erişmesi için uygunNCmontajı çok önemlidir. İlginçtir ki, NNS viral polimerazlarının yapısal analizlerine dayanarak, birkaç N proteininin, RNA sentezi 6 ,7,8,9,10,11,12’densonra polimerazın erişimine izin vermek için NC’lerden geçici olarak ayrıştıği varsayılıyor.
Şu anda, RSV RNA polimerizasyon tahlilleri, kısa çıplak RNA şablonları13 , 14üzerinde saflaştırılmış RSV polimeraz kullanılarak kurulmuştur. Bununla birlikte, RSV polimerazının faaliyetleri, çıplak RNA şablonları kullanılırken RSV polimeraz tarafından üretilen işlemsel olmayan ve iptal edici ürünlerde gözlendiği gibi optimale ulaşmaz. Virüse özgü RNA ile NC eksikliği, RSV RNA sentezinin daha fazla mekanistik anlaşılması için birincil engeldir. Bu nedenle, özgün bir RNA şablonu kullanmak, RSV RNA sentezinin temel bilgisini ilerletmek için kritik bir ihtiyaç haline gelir. RSV ve diğer NNS RNA virüslerinden gelen nükleapsid benzeri parçacıkların (NCLP’ ler) bilinen yapıları, NCLP’lerdeki RNA’ların rastgele hücresel RNA’lar veya ortalama viral genomikRNA’lar 15 , 16,17,18,19olduğunu ortaya koymaktadır. Birlikte, ana engel, N ana hücrelerde aşırı ifade edildiğinde N’nin NCLP’leri oluşturmak için özellikle hücresel RNA’lara bağlanmamasıdır.
Bu engeli aşmak için, önce RNA içermeyen (N0)elde etmek ve N0’ı otantik viral genomik RNA ile NCLPs20‘ye monte etmek için bir protokol oluşturduk. Bu protokolün prensibi, RSV fosfoprotein (PNTD)N-terminal etki alanı olan N’yi bir refakatçi ile birlikte ifade ederek büyük miktarda rekombinant RNA içermeyen N (N0)elde etmektir. Saflaştırılmış N0P, RSV’ye özgü RNA oligos eklenerek UYARılabilir ve NCLP’lere monte edilebilir ve montaj işlemi sırasında, RNA oligos ilavesi üzerine refakatçi PNTD yer değiştirir.
Burada, RSV RNA’ya özgü NC’lerin üretimi ve montajı için bir protokol detaylandırıyoruz. Bu protokolde moleküler klonlama, protein hazırlama, in vitro montaj ve karmaşık montajın doğrulanmasını tarif ediyoruz. Moleküler klonlama için protein koexpressyonu için bi-cistronic yapılar oluşturmak için klonlama stratejisini vurguluyoruz. Protein hazırlama için hücre kültürü, protein ekstraksiyonu ve protein kompleksinin saflaştırılması prosedürlerini açıklıyoruz. Daha sonra RSV RNA’ya özgü NC’lerin in vitro montajı yöntemini tartışıyoruz. Son olarak, monte edilen NCLP’leri karakterize etmek ve görselleştirmek için boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve negatif leke elektron mikroskopisi (EM) kullanıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nonsegmented negatif duyu (NNS) RNA virüslerinin bilinen nükleocapsid benzeri parçacık (NCLP) yapıları, birleştirilmiş NCLP’lerin bakteriyel veya ökaryotik ifade sistemlerinde aşırı ifade edildiğinde konak hücresel RNA’lara sahip karmaşık N olduğunu göstermektedir15,16,17,18,19. Önceki çalışmalar, RNase A sindirimi, yüksek tuz yıkama ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Emory’deki Liang laboratuvarındaki araştırma programları, ABD Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından R01GM130950 ödül numarası altında ve Emory Üniversitesi Tıp Fakültesi’ndeki Araştırma Başlangıç Fonu tarafından desteklenmektedir. Yazar, Liang laboratuvarı üyelerini yararlı destek ve eleştirel tartışma için kabul eder.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
