Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus
Summary
Voor een diepgaande mechanistische analyse van de RNA-synthese van het respiratoire syncytiële virus (RSV) rapporteren we een protocol voor het gebruik van de chaperonnefofoproteïne (P) voor coexpressie van het RNA-vrije nucleoproteïne (N0) voor de daaropvolgende in vitro assemblage van de virusspecifieke nucleocapsiden (NCs).
Abstract
Het gebruik van een authentieke RNA-sjabloon is van cruciaal belang om de fundamentele kennis van virale RNA-synthese te bevorderen die zowel mechanistische ontdekking als testontwikkeling in virologie kan begeleiden. De RNA-sjabloon van niet-gesegmenteerde RNA-virussen (NNS) met negatieve zin, zoals het respiratoire syncytiële virus (RSV), is niet alleen een RNA-molecuul, maar eerder een nucleoproteïne (N) ingekapseld ribonucleoproteïnecomplex. Ondanks het belang van het authentieke RNA-sjabloon, blijft het genereren en assembleren van een dergelijk ribonucleoproteïnecomplex verfijnd en vereist het diepgaande opheldering. De belangrijkste uitdaging is dat de overexpressed RSV N niet specifiek bindt aan cellulaire RNA’s om willekeurige nucleocapsid-achtige deeltjes (NCLPs) te vormen. Hier hebben we een protocol opgesteld om RNA-vrije N (N0) eerst te verkrijgen door N samen met een chaperonnefofoproteïne (P) uit te drukken en vervolgens N0 met RNA-oligo’s samen te stellen met de RSV-specifieke RNA-sequentie om virusspecifieke nucleocapsiden (NCs) te verkrijgen. Dit protocol laat zien hoe de moeilijkheid bij de voorbereiding van dit traditioneel uitdagende virale ribonucleoproteïnecomplex kan worden overwonnen.
Introduction
Niet-gesegmenteerde RNA-virussen (NNS) met een negatief gevoel omvatten veel significante menselijke pathogenen, zoals rabiës, ebola en respiratoir syncytieel virus (RSV)1,2. RSV is de belangrijkste oorzaak van aandoeningen van de luchtwegen zoals bronchiolitis en longontsteking bij jonge kinderen en oudere volwassenen wereldwijd3. Momenteel zijn er geen effectieve vaccins of antivirale therapieën beschikbaar om RSV4te voorkomen of te behandelen. Als onderdeel van de levenscyclus dient het RSV-genoom als sjabloon voor replicatie door het RSV RNA-afhankelijke RNA-polymerase om een antigenoom te produceren, dat op zijn beurt fungeert als de sjabloon om een nageslachtgenoom te genereren. Zowel genoom als antigenoom RNA’s worden volledig ingekapseld door het nucleoproteïne (N) om de nucleocapsiden (NCs) te vormen3. Omdat de NCs dienen als sjablonen voor zowel replicatie als transcriptie door de RSV-polymerase, is een goede NC-assemblage cruciaal voor de polymerase om toegang te krijgen tot de sjablonen voorRNA-synthese 5. Interessant is dat op basis van de structurele analyses van de NNS virale polymerases wordt verondersteld dat verschillende N-eiwitten zich tijdelijk distantiëren van de NCs om de toegang tot het polymerase mogelijk te maken en na de RNA-synthese6, 7,8,9,10,11,12toegang te geven tot RNA .
Momenteel is de RSV RNA-polymerisatietest vastgesteld met behulp van gezuiverde RSV-polymerase op korte naakte RNA-sjablonen13,14. De activiteiten van de RSV-polymerase bereiken echter niet optimaal, zoals waargenomen in de niet-processieve en abortieve producten die door de RSV-polymerase worden gegenereerd bij het gebruik van naakte RNA-sjablonen. Het ontbreken van NC met virusspecifiek RNA is een primaire barrière voor het verdere mechanistische begrip van de RSV RNA-synthese. Daarom wordt het gebruik van een authentieke RNA-sjabloon een essentiële noodzaak om de fundamentele kennis van RSV RNA-synthese te bevorderen. De bekende structuren van de nucleocapsid-achtige deeltjes (NCLPs) van RSV en andere NNS RNA-virussen onthullen dat de RNA ‘s in de NCLPs ofwel willekeurige cellulaire RNA ‘s zijn ofwel gemiddelde virale genomische RNA ‘s15,16,17,18,19. Samen is de belangrijkste hindernis dat N niet specifiek aan cellulaire RNA’s bindt om NCLPs te vormen wanneer N wordt overexpressed in de gastheercellen.
Om deze hindernis te overwinnen, hebben we eerst een protocol opgesteld om RNA-vrij (N0) te verkrijgen en N0 met authentiek viraal genomisch RNA in NCLPs20te assembleren. Het principe van dit protocol is het verkrijgen van een grote hoeveelheid recombinante RNA-vrije N (N0) door N samen met een chaperonne uit te drukken, het N-terminale domein van RSV-fosfoproteïne (PNTD). De gezuiverde N0P kan worden gestimuleerd en geassembleerd in NCLPs door RSV-specifieke RNA-oligo’s toe te voegen, en tijdens het assemblageproces wordt de chaperonne PNTD verplaatst bij de toevoeging van RNA-oligo’s.
Hier beschrijven we een protocol voor het genereren en assembleren van RSV RNA-specifieke NCs. In dit protocol beschrijven we het moleculair klonen, eiwitpreparaat, in vitro assemblage en validatie van de complexe assemblage. We benadrukken de kloonstrategie om bi-cistronic constructies te genereren voor eiwitcoexpressie voor moleculair klonen. Voor eiwitbereiding beschrijven we de procedures van celkweek, eiwitextractie en de zuivering van het eiwitcomplex. Vervolgens bespreken we de methode voor in vitro assemblage van de RSV RNA-specifieke NC’s. Ten slotte gebruiken we grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) en negatieve vlekelektronenmicroscopie (EM) om de geassembleerde NCLPs te karakteriseren en te visualiseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bekende nucleocapsid-achtige deeltjesstructuren (NCLP) van de niet-gesegmenteerde RNA-virussen met negatieve zin (NNS) tonen aan dat de geassembleerde NCLPs de complexe N met host cellulaire RNA ‘s zijn wanneer ze overexpressie vertonen in bacteriële of eukaryotische expressiesystemen15,16,17,18,19. Eerdere studies hebben geprobeerd om de RNA-vrije N te kr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De onderzoeksprogramma’s in het Liang-laboratorium in Emory worden ondersteund door het Us National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) onder het toekenningsnummer R01GM130950 en het Research Start-Up Fund van emory University School of Medicine. De auteur erkent de leden van het Liang-laboratorium voor nuttige ondersteuning en kritische discussie.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
