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Biochemistry

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

Published: July 27, 2021
doi:
10.3791/62010
, , , ,
1Department of Biochemistry,Emory University School of Medicine

Summary

呼吸合体ウイルス(RSV)RNA合成の詳細な機械分析のために、RNA非含核タンパク質(N0)をウイルス特異的ヌクレオキャプシド(NC)のその後のインビトロ集合体に対するRNAフリー核タンパク質(N0)の共発現にシャペロンホスホタンパク質(P)を利用するプロトコルを報告する。

Abstract

本物のRNAテンプレートの使用は、ウイルス学における機械学的発見とアッセイの開発の両方を導くことができるウイルスRNA合成の基本的な知識を進めるために重要です。非セグメント化陰性感覚(NNS)RNAウイルスのRNAテンプレートは、呼吸間核ウイルス(RSV)のような、RNA分子のみではなく、むしろ核タンパク質(N)を封入したリボヌクレオタンパク質複合体である。本物のRNAテンプレートの重要性にもかかわらず、このようなリボヌクレオタンパク質複合体の生成および組立は洗練されたままであり、詳細な解明を必要とします。主な課題は、過剰発現したRSV Nが細胞RNAに非特異的に結合してランダムなヌクレオキャプシド様粒子(NCLPs)を形成することである。ここでは、まずNをシャペロンホスホ蛋白質(P)と共発現させ、次にRSV特異的RNA配列を用いてN0を組み立ててウイルス特異的ヌクレオキャプシド(NC)を得ることでRNAフリーN(N0)を得るプロトコルを確立した。このプロトコルは、この伝統的に挑戦的なウイルスリボヌクレオタンパク質複合体の調製における困難を克服する方法を示しています。

Introduction

非セグメント化負感覚(NNS)RNAウイルスは、狂犬病、エボラ出血熱、および呼吸器間質ウイルス(RSV)1、2のような多くの重要なヒト病原体を含む。RSVは、世界中の幼児および高齢者における気管支炎および肺炎などの呼吸器疾患の主な原因である。現在、RSV4を予防または治療するための有効なワクチンや抗ウイルス療法は利用できません。ライフサイクルの一環として、RSVゲノムは、RSV RNA依存性RNAポリメラーゼによる複製の鋳型として、抗ゲノムを産生し、その結果、子孫ゲノムを生成する鋳型として機能します。ゲノムおよび抗ゲノムRNAはいずれも、核タンパク質(N)によって完全に封入され、ヌクレオキャプシド(NC)3を形成する。NCはRSVポリメラーゼによる複製と転写の両方のテンプレートとして機能するため、ポリメラーゼがRNA合成用テンプレートにアクセスするには適切なNCアセンブリが不可欠です。興味深いことに、NNSウイルスポリメラーゼの構造解析に基づいて、いくつかのNタンパク質が一過性にNCから解離して、RNA合成後にRNAに対してポリメラーゼのアクセスを可能にし、RNAに再結合することを仮説する6、7、8、9、10、11、12。

現在、RSV RNA重合アッセイは、短裸RNAテンプレート13,14に精製されたRSVポリメラーゼを用いて確立されている。しかし、裸のRNAテンプレートを使用する場合、RSVポリメラーゼによって生成された非プロセスおよび中止産物に観察されるように、RSVポリメラーゼの活動は最適に達しない。ウイルス特異的なRNAを用いるNCの欠如は、RSV RNA合成のさらなる機械化的理解のための主要な障壁である。したがって、本物のRNAテンプレートを使用することは、RSV RNA合成の基礎知識を進めるために重要な必要性になります。RSVおよび他のNNS RNAウイルスからのヌクレオカプシド様粒子(NCLPs)の既知の構造は、NCLPs中のRNAがランダムな細胞RNAまたは平均ウイルスゲノムRNA15、16、17、18、19であることを明らかにする。一緒に、主なハードルは、Nが宿主細胞で過剰発現したときにNCLPsを形成するために非特異的に細胞RNAにNが結合することです。

このハードルを克服するために、まずRNAフリー(N0)を取得し、本物のウイルスゲノムRNAをNCLP20に組み立てるプロトコルを確立しました。このプロトコルの原理は、Nをシャペロンと共発現させることにより組換えRNAフリーN(N0)を大量に得る、RSVホスフォタンパク質のN末端ドメイン(PNTD)である。精製されたN0Pは、RSV特異的なRNAオリゴを添加することによってNCLPに刺激され、組み立てることができ、そして組立プロセス中に、シャペロンPNTDはRNAオリゴの添加時に変位する。

ここでは、RSV RNA特異的なNCの生成と組み立てのためのプロトコルについて詳しく説明します。本プロトコルでは、分子クローニング、タンパク質調製、 インビトロ アセンブリ、および複合アセンブリの検証について説明する。我々は、分子クローニングのためのタンパク質共発現のためのバイシストロニック構築物を生成するためのクローニング戦略を強調する。タンパク質調製については、細胞培養、タンパク質抽出、タンパク質複合体の精製の手順について説明します。次に、RSV RNA特異的NCの インビトロ アセンブリの方法について検討する。最後に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と負染色電子顕微鏡(EM)を使用して、組み立てられたNCLPを特徴付け、可視化します。

Protocol

1. 分子クローニング 注:リガーゼ独立クローニング(LIC)は、RSVビシストロニック共発現コンストラクトプラスミドを作るために使用されました。LICは、1990年代初頭に開発された方法であり、T4 DNAポリメラーゼの3′-5’Exo活性を使用して、ベクターとDNAインサート21,22との相補性を持つオーバーハングを作成する。構築物?…

Representative Results

RNAフリーN0Pタンパク質の精製このプロトコルにより、大規模な可溶性ヘテロダイマーRSVN0P複合体が得られる。Pタンパク質のNおよびN末端部分の全長は、大腸菌のNタンパク質上の10X His-Tagと共に発現した。N0Pをコバルトカラム、イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。N0Pは全長NとN末端Pの両方を含むが、UV吸…

Discussion

非セグメント化陰性感覚(NNS)RNAウイルスの既知のヌクレオカプシド様粒子(NCLP)構造は、細菌または真核生物発現系15、16、17、18、19において過剰発現した場合に、組み立てられたNCLPsが宿主細胞RNAを有する複合体Nであることを示す。これまでの研究では、RNase A消化、高塩?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

エモリーの梁研究室の研究プログラムは、米国国立一般医学研究所(NIGMS)、国立衛生研究所(NIH)の賞番号R01GM130950、エモリー大学医学部の研究スタートアップ基金によって支援されています。著者は、梁研究室のメンバーが有益なサポートと批判的な議論を行っていることを認めています。

Materials

Agarose SIgma A9539-500G making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore UFC901024 concentrate the protein sample
Ampicillin sodium GOLD BIOTECHNOLOGY 5118.111317A antibiotic for cell culture
AseI NEB R0526S making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads Gold Bio H-310-500 For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater CORNING 6885-DB Heate the sample
dCTP Invitrogen 10217016 making construct using LIC method
dGTP Invitrogen 10218014 making construct using LIC method
Glycerol Sigma G5516-4L making solution
HEPES Sigma H3375-100G making solution
HiTrap Q HP Sigma GE29-0513-25 Protein purification
Imidazole Sigma I5513-100G making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) GOLD BIOTECHNOLOGY 1116.071717A induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes VWR 47730-598 for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor SpectraLab MSX-XL-2020 sonicator for lysing cell
Negative stain grids Electron Microscopy Sciences CF400-Cu-TH For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R eppendorf M1282-0000 Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385-1L making solution
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480L PCR
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 Purify DNA
SSPI-HF NEB R3132S making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL Sigma GE29-0915-96 Protein purification
T4 DNA polymerase Sigma 70099-3 making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge Fisher Scientific 36-101-0816 Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride Sigma T3253-250G making solution
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22451 making negative stain solution
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References

  1. Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
  2. Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
  3. Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
  4. Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
  5. Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
  6. Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
  7. Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
  8. Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
  9. Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
  10. Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
  11. Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
  12. Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
  13. Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
  14. Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
  15. Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
  16. Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
  17. Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
  18. Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
  19. Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
  20. Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
  21. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
  22. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  23. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
  24. Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
  25. De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
  26. Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
  27. Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
  28. Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
  29. Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
  30. Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
  31. Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
  32. Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
  33. Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
  34. Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).

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Keywords: Virus-specific NucleocapsidsRespiratory Syncytial VirusRecombinant Viral Protein ExpressionRNA-free N ProteinLigation Independent CloningElectron MicroscopyBi-cistronic ConstructionProtein ExpressionChromatographyCobalt Gravity ColumnQ ColumnHPLCUV Detection

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Gao, Y., Ogilvie, C., Raghavan, A., Von Hoffmann, C., Liang, B. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (173), e62010, doi:10.3791/62010 (2021).
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