Генерация и сборка вирус-специфических нуклеокапсидов респираторно-синцитиального вируса
Summary
Для углубленного механистического анализа синтеза РНК респираторно-синцитиального вируса (RSV) мы сообщаем протокол использования шаперон-фосфопротеина (P) для коэкспрессии свободного от РНК нуклеопротеина (N0)для последующей сборки in vitro вирус-специфических нуклеокапсидов (НК).
Abstract
Использование аутентичного шаблона РНК имеет решающее значение для продвижения фундаментальных знаний о синтезе вирусной РНК, которые могут направлять как механистическое открытие, так и разработку анализов в вирусологии. РНК-шаблон несегментированных РНК-вирусов с отрицательным смыслом (NNS), таких как респираторно-синцитиальный вирус (RSV), представляет собой не только молекулу РНК, а скорее инкапсидированный комплекс рибонуклеопротеинов нуклеопротеинов (N). Несмотря на важность аутентичного шаблона РНК, генерация и сборка такого рибонуклеопротеинового комплекса остаются сложными и требуют глубокого выяснения. Основная проблема заключается в том, что сверхэкспрессированный RSV N связывается не зреть с клеточными РНК с образованием случайных нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP). Здесь мы установили протокол для полученияN(N0)без РНК сначала путем совместной экспрессии N с шапероном фосфопротеином (P), затем сборки N0 с олигосами РНК с RSV-специфической последовательностью РНК для получения вирус-специфических нуклеокапсидов (НК). Этот протокол показывает, как преодолеть трудности в приготовлении этого традиционно сложного вирусного рибонуклеопротеинового комплекса.
Introduction
Несегментированные РНК-вирусы отрицательного смысла (NNS) включают в себя многие значимые патогены человека, такие как бешенство, Эбола и респираторно-синцитиальный вирус (RSV)1,2. РСВ является основной причиной респираторных заболеваний, таких как бронхиолит и пневмония у маленьких детей и пожилых людей во всем мире3. В настоящее время нет эффективных вакцин или противовирусных препаратов для профилактики или лечения RSV4. Как часть жизненного цикла, геном RSV служит шаблоном для репликации RSV-РНК-зависимой РНК-полимеразой для получения антигенома, который, в свою очередь, действует как шаблон для генерации генома потомства. Как геномные, так и антигеномные РНК полностью инкапсированы нуклеопротеином (N) с образованием нуклеокапсидов(НК) 3. Поскольку НК служат шаблонами как для репликации, так и для транскрипции полимеразой RSV, правильная сборка NC имеет решающее значение для полимеразы, чтобы получить доступ к шаблонам синтеза РНК5. Интересно, что на основе структурного анализа вирусных полимераз NNS предполагается, что несколько N-белков временно диссоциируют от НК, чтобы обеспечить доступ полимеразы и повторно привязываться к РНК после синтеза РНК6,7,8,9,10,11,12.
В настоящее время установлен анализ полимеризации РНК РСВ с использованием очищенной РСВ-полимеразы на коротких голых РНК-шаблонах13,14. Однако активность РСВ-полимеразы не достигает оптимального, как это наблюдается в необрабатывающих и абортивных продуктах, образующихся RSV-полимеразой при использовании голых шаблонов РНК. Отсутствие NC с вирус-специфической РНК является основным барьером для дальнейшего механистического понимания синтеза РНК RSV. Поэтому использование аутентичного шаблона РНК становится критической необходимостью для продвижения фундаментальных знаний о синтезе РНК RSV. Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) из RSV и других РНК-вирусов NNS показывают, что РНК в NCLP являются либо случайными клеточными РНК, либо средними вирусными геномными РНК15,16,17,18,19. В совокупности основное препятствие заключается в том, что N связывается не специфически с клеточными РНК, образуя NCLP, когда N чрезмерно экспрессируется в клетках-хозяевах.
Чтобы преодолеть это препятствие, мы установили протокол для получения без РНК (N0)и сборки N0 с подлинной вирусной геномной РНК в NCLP20. Принцип этого протокола заключается в получении большого количества рекомбинантного РНК-свободного N(N0)путем совместной экспрессии N с шапероном, N-концевым доменом RSV фосфопротеина (PNTD). Очищенный N 0 P можетбытьстимулирован и собран в NCLP путем добавления RSV-специфических олигов РНК, и во время процесса сборки шаперон PNTD смещается при добавлении ОлигоС РНК.
Здесь мы подробно описываем протокол для генерации и сборки РНК-специфических для RSV НК. В этом протоколе мы описываем молекулярное клонирование, подготовку белка, сборку in vitro и валидацию сложной сборки. Выделена стратегия клонирования для создания бицистронных конструкций для коэкспрессии белка для молекулярного клонирования. Для приготовления белка мы описываем процедуры клеточной культуры, экстракции белка и очистки белкового комплекса. Затем мы обсудим метод сборки in vitro РНК-специфических НК RSV. Наконец, мы используем хроматографию исключения размеров (SEC) и электронную микроскопию с отрицательным пятном (EM) для характеристики и визуализации собранных NCLP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Известные структуры нуклеокапсидоподобных частиц (NCLP) несегментированных РНК-вирусов отрицательного смысла (NNS) показывают, что собранные NCLP представляют собой комплекс N с клеточными РНК хозяина при сверхэкспрессии в бактериальных или эукариотических системах экспрессии15,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследовательские программы в лаборатории Лян в Эмори поддерживаются Национальным институтом общих медицинских наук США (NIGMS), Национальными институтами здравоохранения (NIH) под номером R01GM130950 и Фондом исследовательских стартапов в Медицинской школе Университета Эмори. Автор благодарит членов лаборатории Лян за полезную поддержку и критическое обсуждение.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
