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Biochemistry

호흡기 싱크량 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드의 생성 및 조립

Published: July 27, 2021
doi:
10.3791/62010
, , , ,
1Department of Biochemistry,Emory University School of Medicine

Summary

호흡기 싱크량 바이러스(RSV) RNA 합성의 심층 기계분석의 경우, 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)의 후속 체외 조립을 위해 RNA-프리 뉴클레오프로틴(N0)의 공동발현을 위해 샤페론 인포단(P)을 활용하는 프로토콜을 보고한다.

Abstract

본격적인 RNA 템플릿의 사용은 바이러스학의 기계성 발견과 분석 개발을 모두 안내 할 수있는 바이러스 RNA 합성의 기본 지식을 발전시키는 데 중요합니다. 호흡기 싱크로바이러스(RSV)와 같은 비분할 음성감각(NNS) RNA 바이러스의 RNA 템플릿은 RNA 분자만이 아니라 오히려 리보뉴클레오단백질 복합체를 캡슐화한 뉴클레오단백질(N)이다. 본격적인 RNA 템플릿의 중요성에도 불구하고, 이러한 리보뉴클레오단백질 복합체의 생성 및 조립은 정교하게 유지되고 심층적인 용해가 필요합니다. 주요 과제는 과발현된 RSV N이 임의의 뉴클레오캡시드 와 같은 입자(NCLPs)를 형성하기 위해 세포 RNA에 비특이적 결합한다는 것입니다. 여기서, 먼저 n을 샤페론 인포단(P)으로 공동 발현한 다음, RNA 올리고스와 함께N0을 조립하여 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드(NC)를 획득하는 프로토콜을 확립하였다. 이 프로토콜은 이 전통적으로 도전적인 바이러스성 리보뉴클레오단백질 복합체의 준비에 있는 어려움을 극복하는 방법을 보여줍니다.

Introduction

비분할 음성 감각(NNS) RNA 바이러스는 광견병, 에볼라 및 호흡 싱크바이러스(RSV)1,2와같은 많은 중요한 인간 병원균을 포함한다. RSV는 전 세계3명의어린이와 노인의 기관지염 및 폐렴과 같은 호흡기 질환의 주요 원인입니다. 현재, RSV4를예방하거나 치료하기 위해 효과적인 백신이나 항바이러스 요법을 사용할 수 없다. 수명 주기의 일환으로, RSV 게놈은 RSV RNA 의존RNA 폴리머라제에 의한 복제를 위한 템플릿으로서 작용하여 항게놈을 생성하며, 이는 차례로 자손 게놈을 생성하는 템플릿으로서 작용한다. 게놈 및 항게놈 RNA는 뉴클레오캡시드(N)를 형성하기 위해 뉴클레오프로틴(N)에 의해 완전히 캡슐화되어3. NC는 RSV 폴리머라제에 의한 복제 및 전사 모두에 대한 템플릿역할을 하기 때문에, 적절한 NC 어셈블리는 중합체가 RNA 합성5에대한 템플릿에 접근하는 것이 중요하다. 흥미롭게도, NNS 바이러스 성 중합체의 구조적 분석에 기초하여, 몇몇 N 단백질이 RNA 합성 후 RNA에 중합효소의 접근을 허용하고 RNA에 재결합하기 위해여러 N 단백질이 과도하게 해리되고 RNA6,7,8,9,10,11,12가가설된다.

현재, RSV RNA 중합 분석은 짧은 알몸 RNA템플릿(13,14)에정제된 RSV 폴리머라제를 사용하여 확립되었다. 그러나, RSV 폴리머라제의 활동은 알몸 RNA 템플릿을 사용할 때 RSV 폴리머라제에 의해 생성된 비공정 및 중단 성 제품에서 관찰된 바와 같이 최적에 도달하지 못한다. 바이러스 특이적 RNA를 가진 NC의 부족은 RSV RNA 합성의 추가 기계론적인 이해를 위한 1 차적인 장벽입니다. 따라서, 본격적인 RNA 템플릿을 사용하는 것은 RSV RNA 합성의 근본적인 지식을 발전시키기 위하여 중요한 필요가 된다. RSV 및 기타 NNS RNA 바이러스로부터뉴클레오캡시드 유사 입자(NCLPs)의 공지된 구조는 NCLP내의 RNA가 임의의 세포 RNA 또는 평균 바이러스 게놈 RNA15,16,17,18,19임을드러낸다. 함께, 주요 장애물은 N이 호스트 세포에서 과발현될 때 N이 NCLP를 형성하기 위하여 세포 RNA에 비특이적 결합한다는 것입니다.

이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 먼저 RNA가없는 (N0)을얻고 NCLPs20에정통 바이러스 게놈 RNA와 N0을 조립하는 프로토콜을 설립했다. 이 프로토콜의 원리는 RSV 인포프로틴(PNTD)의N-단자 도메인인 샤페론과 N을 공동 발현함으로써 다량의 재조합 RNA-free N(N0)을획득하는 것이다. 정제된 N0P는 RSV 특이적 RNA 올리고를 첨가하여 NCLPs로 자극및 조립될 수 있으며, 조립 과정에서, 샤페론 PNTD는 RNA 올리고스의 첨가시 변위된다.

여기서는 RSV RNA 특이적 NC의 생성 및 조립을 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 분자 복제, 단백질 제제, 시험관 내 조립 및 복잡한 조립의 유효성검사를 설명합니다. 분자 복제를 위한 단백질 공동발현을 위한 바이-시스트로닉 구조를 생성하는 복제 전략을 강조합니다. 단백질 제제를 위해, 우리는 세포 배양, 단백질 추출 및 단백질 복합체의 정제의 절차를 설명합니다. 그런 다음 RSV RNA 특이적 종크의 체외 조립 방법을 논의합니다. 마지막으로, 당사는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 음수 얼룩 전자 현미경(EM)을 사용하여 조립된 NCLP의 특성화 및 시각화를 합니다.

Protocol

1. 분자 복제 참고: 리가제 독립 복제(LIC)는 RSV 바이시스트로닉 공동발현 생성물 플라스미드를 만드는 데 사용되었습니다. LIC는 1990년대 초에 개발된 방법으로, T4 DNA 폴리머라제의 3′-5′ 엑소 활성을 사용하여 벡터와 DNA인서트(21,22)사이의 상호 보완성을 가진 오버행을 생성한다. 구조는 오픈 리딩 프레임(ORF)(도 1)의 N 단말?…

Representative Results

RNA 가 없는 N0P 단백질의 정제이 프로토콜을 사용하면 대규모 용해성 RSV N0P 복합체를 얻을 수 있습니다. P 단백질의 N 및 N 말단 부분의 전체 길이는 대장균에서N 단백질에 대한 10배 의 His-Tag로 공동 발현되었다. N0P는 코발트 컬럼, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. N0P는 전길이 N 및 N 단자 P를 모두 포함하지만 UV ?…

Discussion

비분할 음성 감지(NNS) RNA 바이러스의 공지된 뉴클레오캡시드 형 입자(NCLP) 구조는 조립된 NCLP가 세균성 또는 진핵발현시스템(15,16,17,18,19)에서과발현될 때 숙주 세포 RNA를 가진 복잡한 N임을 보여준다. 이전 연구는 RNase A 소화, 높은 염분 세척, 또는 비특이적 세포…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

에모리의 리앙 연구소의 연구 프로그램은 미국 국립 일반 의학 연구소(NIGMS), 국립 보건원(NIH)이 수상 번호 R01GM130950에 따라 지원되며, 에모리 대학 의과 대학의 연구 스타트업 기금이 지원됩니다. 저자는 도움이 지원과 비판적 토론을 위해 Liang 연구소의 구성원을 인정한다.

Materials

Agarose SIgma A9539-500G making construct using LIC method
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Millipore UFC901024 concentrate the protein sample
Ampicillin sodium GOLD BIOTECHNOLOGY 5118.111317A antibiotic for cell culture
AseI NEB R0526S making construct using LIC method
Cobalt (High Density) Agarose Beads Gold Bio H-310-500 For purification of His-tag protein
Corning LSE Digital Dry Bath Heater CORNING 6885-DB Heate the sample
dCTP Invitrogen 10217016 making construct using LIC method
dGTP Invitrogen 10218014 making construct using LIC method
Glycerol Sigma G5516-4L making solution
HEPES Sigma H3375-100G making solution
HiTrap Q HP Sigma GE29-0513-25 Protein purification
Imidazole Sigma I5513-100G making solution
IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) GOLD BIOTECHNOLOGY 1116.071717A induce the expression of protein
Microcentrifuge Tubes VWR 47730-598 for PCR
Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor SpectraLab MSX-XL-2020 sonicator for lysing cell
Negative stain grids Electron Microscopy Sciences CF400-Cu-TH For making negative stain grids
New Brunswick Innova 44/44R eppendorf M1282-0000 Shaker for culturing the cell
Nonidet P 40 Substitute Sigma 74385-1L making solution
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480L PCR
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 Purify DNA
SSPI-HF NEB R3132S making construct using LIC method
Superose 6 Increase 10/300 GL Sigma GE29-0915-96 Protein purification
T4 DNA polymerase Sigma 70099-3 making construct using LIC method
Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge Fisher Scientific 36-101-0816 Centrifuge, highest speed 20,000 rpm
Trizma hydrochloride Sigma T3253-250G making solution
Uranyl Formate Electron Microscopy Sciences 22451 making negative stain solution
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References

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Keywords: Virus-specific NucleocapsidsRespiratory Syncytial VirusRecombinant Viral Protein ExpressionRNA-free N ProteinLigation Independent CloningElectron MicroscopyBi-cistronic ConstructionProtein ExpressionChromatographyCobalt Gravity ColumnQ ColumnHPLCUV Detection

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Gao, Y., Ogilvie, C., Raghavan, A., Von Hoffmann, C., Liang, B. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (173), e62010, doi:10.3791/62010 (2021).
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