Generering og samling af virusspecifikke nukleocapsider af respiratorisk syncytial virus
Summary
Til dybdegående mekanistisk analyse af respiratorisk syncytial virus (RSV) RNA-syntese rapporterer vi en protokol om anvendelse af chaperonphoprotein (P) til coexpression af RNA-fri nucleoprotein (N0)til efterfølgende in vitro-samling af de virusspecifikke nucleocapsider (NCs).
Abstract
Brugen af en autentisk RNA-skabelon er afgørende for at fremme den grundlæggende viden om viral RNA-syntese, der kan guide både mekanistisk opdagelse og analyseudvikling inden for virologi. RNA-skabelonen af ikke-segmenterede RNA-vira (negative-sense) såsom respiratorisk syncytial virus (RSV) er ikke et RNA-molekyle alene, men snarere et nucleoprotein (N) indkapslet ribonukleoproteinkompleks. På trods af vigtigheden af den autentiske RNA-skabelon forbliver generering og samling af et sådant ribonukleoproteinkompleks sofistikeret og kræver dybdegående belysning. Den største udfordring er, at den overekspresserede RSV N binder ikke-specifikt til cellulære RNA’er til at danne tilfældige nucleocapsid-lignende partikler (NCB’er). Her etablerede vi en protokol for at opnå RNA-fri N (N0) først ved at co-udtrykke N med en chaperone phosphoprotein (P), derefter samle N0 med RNA oligos med RSV-specifikke RNA-sekvens for at opnå virus-specifikke nucleocapsids (NCs). Denne protokol viser, hvordan man overvinder vanskeligheden ved forberedelsen af dette traditionelt udfordrende virale ribonukleoproteinkompleks.
Introduction
Ikke-segmenterede RNA-vira (negative-sense) omfatter mange betydelige menneskelige patogener, såsom rabies, ebola og respiratorisk syncytial virus (RSV)1,2. RSV er den hyppigste årsag til luftvejssygdomme såsom bronchiolitis og lungebetændelse hos små børn og ældre voksne over hele verden3. I øjeblikket er der ingen effektive vacciner eller antivirale behandlinger til rådighed til at forebygge eller behandle RSV4. Som en del af livscyklussen fungerer RSV-genomet som skabelon for replikation af RSV RNA-afhængig RNA-polymerase for at producere et antigenom, som igen fungerer som skabelon til at generere et afkomgengenom. Både genom og antigenome RNA’er er helt indkapslet af nucleoprotein (N) til at danne nucleocapsids (NCs)3. Da NC’erne fungerer som skabeloner for både replikering og transskription af RSV-polymerasen, er korrekt NC-samling afgørende for, at polymerasen kan få adgang til skabelonerne til RNA-syntese5. Interessant, baseret på de strukturelle analyser af NNS virale polymeraser, er det hypotese, at flere N proteiner forbigående dissociate fra NCs at give adgang til polymerase og rebind til RNA efter RNA syntese6, 7,8,9,10,11,12.
I øjeblikket er RSV RNA polymeriseringsanalysen blevet etableret ved hjælp af renset RSV polymerase på korte nøgne RNA-skabeloner13,14. RSV-polymerase’s aktiviteter når imidlertid ikke optimale, som observeret i de ikke-procesive og abortive produkter, der genereres af RSV polymerase, når du bruger nøgne RNA-skabeloner. Manglen på NC med virusspecifikt RNA er en primær barriere for den yderligere mekanistiske forståelse af RSV RNA-syntesen. Derfor bliver brug af en autentisk RNA-skabelon et kritisk behov for at fremme den grundlæggende viden om RSV RNA-syntese. De kendte strukturer af nucleocapsid-lignende partikler (NCPI’er) fra RSV og andre NNS RNA-vira afslører, at RNA’erne i NCLP’erne enten er tilfældige cellulære RNA’er eller gennemsnitlige virale genomiske RNA’er15,16,17,18,19. Sammen er den største forhindring, at N binder ikke-specifikt til cellulære RNA’er for at danne NCLPs, når N er overekspresseret i værtscellerne.
For at overvinde denne forhindring etablerede vi en protokol for at opnå RNA-fri (N0)først og samle N0 med autentisk viral genomisk RNA i NCLPs20. Princippet i denne protokol er at opnå en stor mængde rekombinant RNA-fri N (N0)ved at co-udtrykke N med en anstandsdame, N-terminal domæne RSV phosphoprotein (PNTD). Den rensede N0P kunne stimuleres og samles i NCB’er ved at tilføje RSV-specifikke RNA oligoer, og under samlingsprocessen forskydes chaperon PNTD ved tilsætning af RNA oligos.
Her beskriver vi en protokol for generering og samling af RSV RNA-specifikke NCs. I denne protokol beskriver vi molekylær kloning, proteinpræparat, in vitro-samling og validering af den komplekse samling. Vi fremhæver kloningsstrategien for at generere bi-cistronic konstruktioner til protein coexpression til molekylær kloning. Til proteinpræparat beskriver vi procedurerne for cellekultur, proteinudvinding og rensning af proteinkomplekset. Derefter diskuterer vi metoden til in vitro-samling af RSV RNA-specifikke NCs. Endelig bruger vi størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC) og negativ pletelektronmikroskopi (EM) til at karakterisere og visualisere de samlede NCKLU’er.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kendte nucleocapsid-lignende partikel (NCLP) strukturer af nonsegmented negative-sense (NNS) RNA-vira viser, at de samlede NCLPs er de komplekse N med vært cellulære RNA’er, når overekspresseret i bakterielle eller eukaryote udtrykssystemer15,16,17,18,19. Tidligere undersøgelser har forsøgt at få RNA gratis N med en række forskellige metoder, såsom …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningsprogrammerne i Liang-laboratoriet på Emory støttes af US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) under tildelingsnummer R01GM130950 og Research Start-Up Fund på Emory University School of Medicine. Forfatteren anerkender medlemmerne af Liang laboratoriet for nyttig støtte og kritisk diskussion.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
