श्वसन सिंकिटियल वायरस के वायरस-विशिष्ट न्यूक्लियोकैप्सिड्स की पीढ़ी और असेंबली
Summary
श्वसन सिंकिटियल वायरस (आरएसवी) आरएनए संश्लेषण के गहन यंत्रवादी विश्लेषण के लिए, हम वायरस-विशिष्ट न्यूक्लियोकैप्सिड्स (एनसीएस) के विट्रो असेंबली में बाद में आरएनए-मुक्त न्यूकोप्रोटीन (एन0)के सह-प्रसार के लिए चैपरवन फॉस्फोप्रोटीन (पी) का उपयोग करने के प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।
Abstract
वायरल आरएनए संश्लेषण के मौलिक ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए एक प्रामाणिक आरएनए टेम्पलेट का उपयोग महत्वपूर्ण है जो वायरोलॉजी में मशीनी खोज और परख विकास दोनों का मार्गदर्शन कर सकता है। नॉनसगमेंटेड निगेटिव-सेंस (एनएनएस) आरएनए वायरस का आरएनए टेम्पलेट, जैसे श्वसन सिंक्सिटियल वायरस (आरएसवी), अकेले आरएनए अणु नहीं बल्कि एक न्यूक्लियोप्रोटीन (एन) एनकैप्सीडेटेड रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स है । प्रामाणिक आरएनए टेम्पलेट के महत्व के बावजूद, इस तरह के राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन परिसर की पीढ़ी और असेंबली परिष्कृत रहती है और गहराई से स्पष्ट करने की आवश्यकता होती है। मुख्य चुनौती यह है कि अतिव्यक्त आरएसवी एन यादृच्छिक न्यूक्लियोकैप्सिड जैसे कणों (एनसीएलआरपीएस) बनाने के लिए गैर-विशेष रूप से सेलुलर आरएनए को बांधता है। यहां, हमने आरएनए-फ्री एन (एन0)को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया, जो पहले एक चैपरवन फॉस्फोप्रोटीन (पी) के साथ एन को सह-व्यक्त करता है, फिर वायरस-विशिष्ट न्यूकॉकैप्सिड (एनसी) प्राप्त करने के लिए आरएसवी-विशिष्ट आरएनए अनुक्रम के साथ आरएनए ओलिगोस के साथ एन0 को इकट्ठा करता है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि इस पारंपरिक रूप से चुनौतीपूर्ण वायरल रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स की तैयारी में कठिनाई को कैसे दूर किया जाए।
Introduction
गैर-संरक्षित नकारात्मक-भावना (एनएनएस) आरएनए वायरस में रेबीज, इबोला और श्वसन सिंक्टियल वायरस (आरएसवी)1,2जैसे कई महत्वपूर्ण मानव रोगजनक शामिल हैं। आरएसवी3साल के छोटे बच्चों और बड़े वयस्कों में ब्रोंकिओलाइटिस और निमोनिया जैसी श्वसन बीमारी का प्रमुख कारण है । वर्तमान में, आरएसवी4को रोकने या इलाज करने के लिए कोई प्रभावी टीके या एंटीवायरल उपचार उपलब्ध नहीं हैं। जीवन चक्र के हिस्से के रूप में, आरएसवी जीनोम आरएसवी आरएनए निर्भर आरएनए पॉलीमरेज द्वारा प्रतिकृति के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है ताकि एक एंटीजेनोम का उत्पादन किया जा सके, जो बदले में एक संतान जीनोम उत्पन्न करने के लिए टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है। जीनोम और एंटीजेनोम आरएनए दोनों को न्यूक्लियोप्टोप्रोटीन (एन) द्वारा न्यूक्लियोकैप्सिड्स (एनसी) 3 बनाने के लिए पूरीतरहसे समाहित किया गया है। चूंकि एनसी आरएसवी पॉलीमरेज द्वारा प्रतिकृति और प्रतिलेखन दोनों के लिए टेम्पलेट्स के रूप में काम करते हैं, इसलिए पॉलीमरेज के लिए आरएनए संश्लेषण5के लिए टेम्पलेट्स तक पहुंच प्राप्त करने के लिए उचित एनसी असेंबली महत्वपूर्ण है। दिलचस्प बात यह है कि एनएनएस वायरल पॉलीमेरेरेस के संरचनात्मक विश्लेषणों के आधार पर, यह परिकल्पना की जाती है कि कई एन प्रोटीन एनसी से क्षणिक रूप से अलग होते हैं ताकि आरएनए संश्लेषण6,7,8,8, 9,11,12के बाद पॉलीमरेज और आरईएन तक पुनर्विष्कार की पहुंच की अनुमति दी जा सके।
वर्तमान में, आरएसवी आरएनए बहुलकीकरण परख को छोटे नग्न आरएनए टेम्पलेट्स13, 14पर शुद्ध आरएसवी पॉलीमरेज का उपयोग करकेस्थापितकिया गया है। हालांकि, आरएसवी पॉलीमरेज की गतिविधियां इष्टतम तक नहीं पहुंचती हैं, जैसा कि नग्न आरएनए टेम्पलेट्स का उपयोग करते समय आरएसवी पॉलीमरेज द्वारा उत्पन्न गैर-प्रक्रियाशील और निष्फल उत्पादों में मनाया जाता है। वायरस विशिष्ट आरएनए के साथ नेकां की कमी आरएसवी आरएनए संश्लेषण की आगे की यंत्रवादी समझ के लिए एक प्राथमिक बाधा है । इसलिए, एक प्रामाणिक आरएनए टेम्पलेट का उपयोग आरएसवी आरएनए संश्लेषण के मौलिक ज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता बन जाती है। आरएसवी और अन्य एनएनएस आरएनए वायरस से न्यूक्लियोकैप्सिड जैसे कणों (एनसीएलआरपी) की ज्ञात संरचनाओं से पता चलता है कि एनसीएलपीएस में आरएनए या तो यादृच्छिक सेलुलर आरएनए या औसत वायरल जीनोमिक आरएनए15,16,17,18, 19हैं। एक साथ, मुख्य बाधा यह है कि एन मेजबान कोशिकाओं में एन अतिव्यक्त होने पर एनसीएलपी बनाने के लिए गैर-विशेष रूप से सेलुलर आरएनए को बांधता है।
इस बाधा को दूर करने के लिए, हमने आरएनए-फ्री (एन0)को पहले प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया और एन0 को एनसीएलपीएस20में प्रामाणिक वायरल जीनोमिक आरएनए के साथ इकट्ठा किया। इस प्रोटोकॉल का सिद्धांत आरएसवी फॉस्फोप्रोटीन (पीएनटीडी)के एन-टर्मिनल डोमेन, एक चैपरोन के साथ एन-एक्सप्रेसिंग द्वारा बड़ी मात्रा में पुनर्संयोजन आरएनए-मुक्त एन (एन0)प्राप्त करना है। शुद्ध एन0पी को आरएसवी-विशिष्ट आरएनए ओलिगोस जोड़कर एनसीएलपीएस में उत्तेजित और इकट्ठा किया जा सकता है, और विधानसभा प्रक्रिया के दौरान, चैपरवन पीएनटीडी को आरएनए ओलिगोस के अलावा विस्थापित किया जाता है।
यहां, हम आरएसवी आरएनए-विशिष्ट एनसी की पीढ़ी और असेंबली के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम आणविक क्लोनिंग, प्रोटीन तैयार करने, इन विट्रो असेंबली और जटिल असेंबली के सत्यापन का वर्णन करते हैं। हम आणविक क्लोनिंग के लिए प्रोटीन सहएक्सप्रेशन के लिए द्वि-सिस्ट्रोनिक संरचनाओं को उत्पन्न करने के लिए क्लोनिंग रणनीति को उजागर करते हैं। प्रोटीन तैयार करने के लिए, हम सेल संस्कृति, प्रोटीन निष्कर्षण, और प्रोटीन परिसर की शुद्धि की प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। फिर हम आरएसवी आरएनए-विशिष्ट एनसी की इन विट्रो असेंबली के लिए विधि पर चर्चा करते हैं। अंत में, हम इकट्ठे एनसीएलपी की विशेषता और कल्पना करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी (एसईसी) और नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) का उपयोग करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
गैर-संरक्षित नकारात्मक-भावना (एनएनएस) आरएनए वायरस की ज्ञात न्यूक्लियोकैप्सिड-जैसे कण (एनसीएलपी) संरचनाएं दर्शाती हैं कि इकट्ठे हुए एनसीएलपी मेजबान सेलुलर आरएनए के साथ जटिल एन हैं जब बैक्टीरियल या यू?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एमोरी में लियांग प्रयोगशाला में अनुसंधान कार्यक्रमों को अमेरिका के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान (एनआईजीएमएस), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा पुरस्कार संख्या R01GM130950 के तहत समर्थन दिया जाता है, और एमोरी यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन में रिसर्च स्टार्ट-अप फंड । लेखक सहायक समर्थन और महत्वपूर्ण चर्चा के लिए लियांग प्रयोगशाला के सदस्यों को स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
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