Generering og montering av virusspesifikke nukleocapsids av respiratorisk synytialvirus
Summary
For grundig mekanistisk analyse av respiratorisk synytialvirus (RSV) RNA-syntese, rapporterer vi en protokoll for bruk av chaperone fosfoprotein (P) for samtidig undertrykkelse av RNA-frie nukleoprotein (N0) for etterfølgende in vitro-montering av de virusspesifikke nukleocapsidene (NCs).
Abstract
Bruken av en autentisk RNA-mal er avgjørende for å fremme den grunnleggende kunnskapen om viral RNA-syntese som kan lede både mekanistisk oppdagelse og analyseutvikling i virologi. RNA-malen med ikke-segmenterte NNS-RNA-virus (negative sanser), for eksempel det respiratoriske synytialviruset (RSV), er ikke et RNA-molekyl alene, men snarere et nukleoprotein (N) innkapslet ribonukleoproteinkompleks. Til tross for viktigheten av den autentiske RNA-malen, forblir genereringen og monteringen av et slikt ribonukleoproteinkompleks sofistikert og krever dyptgående belysning. Hovedutfordringen er at de overekspresserte RSV N binder seg ikke spesifikt til cellulære RNAer for å danne tilfeldige nukleocapsid-lignende partikler (NCLPer). Her etablerte vi en protokoll for å få RNA-fri N (N0) først ved å uttrykke N med et anstandsfosfoprotein (P), og deretter montere N0 med RNA oligos med den RSV-spesifikke RNA-sekvensen for å oppnå virusspesifikke nukleocapsids (NCs). Denne protokollen viser hvordan du kan overvinne vanskeligheten i utarbeidelsen av dette tradisjonelt utfordrende virale ribonukleoproteinkomplekset.
Introduction
Ikke-segmentert negativ sans (NNS) RNA-virus inkluderer mange betydelige menneskelige patogener, for eksempel rabies, ebola og respiratorisk synytialvirus (RSV)1,2. RSV er den ledende årsaken til luftveissykdom som bronkiolitt og lungebetennelse hos små barn og eldre voksne over hele verden3. For tiden er ingen effektive vaksiner eller antivirale terapier tilgjengelige for å forhindre eller behandle RSV4. Som en del av livssyklusen fungerer RSV-genomet som mal for replikering av RSV RNA-avhengig RNA-polymerase for å produsere et antigenom, som igjen fungerer som mal for å generere et avkomgenom. Både genom og antigenom RNAer er helt innkapslet av nukleoproteinet (N) for å danne nukleocapsids (NCs)3. Fordi NCene fungerer som maler for både replikering og transkripsjon av RSV-polymerasen, er riktig NC-montering avgjørende for polymerase for å få tilgang til malene for RNA-syntese5. Interessant, basert på de strukturelle analysene av NNS virale polymeraser, er det hypoteset at flere N-proteiner midlertidig dissosierer fra NCene for å tillate tilgang til polymerase og rebind til RNA etter RNA-syntesen6,7,8,9,10,11,12.
For tiden er RSV RNA-polymerisasjonsanalysen etablert ved hjelp av renset RSV-polymerase på korte nakne RNA-maler13,14. RSV-polymerasens aktiviteter når imidlertid ikke optimale, som observert i de ikke-prosessive og abortive produktene som genereres av RSV-polymerasen ved bruk av nakne RNA-maler. Mangelen på NC med virusspesifikk RNA er en primærbarriere for den videre mekanistiske forståelsen av RSV RNA-syntesen. Derfor blir bruk av en autentisk RNA-mal et kritisk behov for å fremme den grunnleggende kunnskapen om RSV RNA-syntese. De kjente strukturene til nukleocapsid-lignende partikler (NCLPer) fra RSV og andre NNS RNA-virus avslører at RNAene i NCLPene enten er tilfeldige cellulære RNAer eller gjennomsnittlig viral genomiske RNAer15,16,17,18,19. Sammen er det viktigste hinderet at N binder seg ikke spesifikt til cellulære RNAer for å danne NCLPer når N er overekspressert i vertscellene.
For å overvinne dette hinderet etablerte vi først en protokoll for å få RNA-fri (N0) og montere N0 med autentisk viral genomisk RNA i NCLPer20. Prinsippet i denne protokollen er å oppnå en stor mengde rekombinant RNA-fri N (N0) ved å uttrykke N sammen med en anstand, N-terminaldomenet til RSV fosfoprotein (PNTD). Den rensede N0P kan stimuleres og monteres i NCLPer ved å legge til RSV-spesifikke RNA oligos, og under monteringsprosessen forskyver chaperone PNTD ved tillegg av RNA oligos.
Her beskriver vi en protokoll for generering og montering av RSV RNA-spesifikke NCer. I denne protokollen beskriver vi molekylær kloning, proteinpreparat, in vitro-montering og validering av den komplekse samlingen. Vi fremhever kloningsstrategien for å generere bi-cistronic konstruksjoner for proteinkoekspressjon for molekylær kloning. For proteinpreparat beskriver vi prosedyrene for cellekultur, proteinutvinning og rensing av proteinkomplekset. Deretter diskuterer vi metoden for in vitro-montering av RSV RNA-spesifikke NCer. Til slutt bruker vi størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og negativ flekkelektronmikroskopi (EM) for å karakterisere og visualisere de monterte NCLPene.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kjente nukleocapsid-lignende partikkelstrukturene (NCLP) til de ikke-segmenterte negative sansene (NNS) RNA-virusene viser at de monterte NCLPene er de komplekse N med vertscelle-RNAer når de overeksponeres i bakterielle eller eukaryote uttrykkssystemer15,16,17,18,19. Tidligere studier har forsøkt å få RNA gratis N med en rekke metoder, for eksempel RNa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningsprogrammene i Liang-laboratoriet ved Emory støttes av US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) under tildelingsnummer R01GM130950, og Research Start-Up Fund ved Emory University School of Medicine. Forfatteren anerkjenner medlemmene av Liang-laboratoriet for nyttig støtte og kritisk diskusjon.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
