Generering och montering av virusspecifika nukleokapslar av respiratoriskt synytialvirus
Summary
För djupgående mekanistisk analys av respiratoriska syncytial virus (RSV) RNA syntes, rapporterar vi ett protokoll om att använda förkläde fosfoprotein (P) för coexpression av RNA-fria nukleoprotein (N0)för efterföljande in vitro montering av virus-specifika nucleocapsids (NCs).
Abstract
Användningen av en autentisk RNA-mall är avgörande för att främja den grundläggande kunskapen om viral RNA-syntes som kan vägleda både mekanistisk upptäckt och analysutveckling inom virologi. RNA-mallen för icke-segmenterade NNS-RNA-virus (negative-sense), såsom respiratoriskt syncytial virus (RSV), är inte en RNA-molekyl ensam utan snarare ett nukleoprotein (N) inkapslat ribonukleoproteinkomplex. Trots vikten av den autentiska RNA mallen, generation och montering av en sådan ribonucleoprotein komplex förblir sofistikerad och kräver djupgående klargörande. Den största utmaningen är att den överuttryckta RSV N binder icke-specifikt till cellulära RNAs för att bilda slumpmässiga nukleocapsidliknande partiklar (NCLPs). Här etablerade vi ett protokoll för att erhålla RNA-fria N (N0) först genom att samreage uttrycka N med ett förkläde fosfoprotein (P), sedan montera N0 med RNA oligos med den RSV-specifika RNA-sekvensen för att erhålla virusspecifika nukleocapsids (NCs). Detta protokoll visar hur man kan övervinna svårigheten vid beredningen av detta traditionellt utmanande virala ribonukleoproteinkomplex.
Introduction
Icke-segmenterade NNS-RNA-virus (Negative Sense) inkluderar många signifikanta mänskliga patogener, såsom rabies, ebola och respiratoriskt syncytial virus (RSV)1,2. RSV är den främsta orsaken till luftvägssjukdom som bronkiolit och lunginflammation hos små barn och äldre vuxna över helavärlden 3. För närvarande finns inga effektiva vacciner eller antivirala behandlingar tillgängliga för att förebygga eller behandla RSV4. Som en del av livscykeln fungerar RSV-genomet som mall för replikering av RSV RNA-beroende RNA-polymeras för att producera ett antigenom, som i sin tur fungerar som mall för att generera ett avkommagenom. Både genom- och antigenom-RNAs är helt inkapslade av nukleoproteinet (N) för att bilda nukleokapslarna (NCs)3. Eftersom NCs fungerar som mallar för både replikering och transkription av RSV-polymerasen, är korrekt NC-sammansättning avgörande för att polymerasen ska få tillgång till mallarna för RNA-syntes5. Intressant nog, baserat på de strukturella analyserna av NNS virala polymeraser, är det hypotetiskt att flera N-proteiner övergående dissocierar från NCs för att tillåta tillgång till polymeras och återbindas till RNA efter RNA-syntesen6,7,8,9,10,11,12.
För närvarande har RSV RNA polymerisationsanalys etablerats med renad RSV-polymeras på korta nakna RNA-mallar13,14. RSV-polymerasens aktiviteter når dock inte optimalt, vilket observerats i de icke-processiva och abortiva produkter som genereras av RSV-polymerasen vid användning av nakna RNA-mallar. Bristen på NC med virusspecifikt RNA är en primär barriär för ytterligare mekanistisk förståelse av RSV RNA-syntesen. Därför blir användning av en autentisk RNA-mall ett kritiskt behov av att främja den grundläggande kunskapen om RSV RNA-syntes. De kända strukturerna hos nukleocapsidliknande partiklar (NCLPs) från RSV och andra NNS RNA-virus avslöjar att RNAs i NCLPs antingen är slumpmässiga cellulära RNAs eller genomsnittliga virala genomiska RNAs15,16,17,18,19. Tillsammans är det största hindret att N binder icke-specifikt till cellulära RNAs för att bilda NCLPs när N är överuttryckt i värdcellerna.
För att övervinna detta hinder etablerade vi ett protokoll för att få RNA-fri (N0)först och montera N0 med autentiskt viralt genomiskt RNA i NCLPs20. Principen för detta protokoll är att erhålla en stor mängd rekombinant RNA-fritt N (N0)genom att samremonera N med ett förkläde, N-terminaldomänen för RSV fosfoprotein (PNTD). Den renade N0P kunde stimuleras och monteras i NCLPs genom att lägga till RSV-specifika RNA oligos, och under monteringsprocessen förskjuts förkläde PNTD vid tillsats av RNA oligos.
Här beskriver vi ett protokoll för generering och montering av RSV RNA-specifika NCs. I detta protokoll beskriver vi molekylär kloning, proteinberedning, in vitro-montering och validering av den komplexa sammansättningen. Vi lyfter fram kloningsstrategin för att generera bi-cistronic konstruktioner för protein coexpression för molekylär kloning. För proteinberedning beskriver vi förfarandena för cellkultur, proteinutvinning och rening av proteinkomplexet. Sedan diskuterar vi metoden för in vitro-montering av de RSV RNA-specifika NCs. Slutligen använder vi storleksuteslutning kromatografi (SEC) och negativ fläck elektronmikroskopi (EM) för att karakterisera och visualisera de monterade NCLPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kända nukleocapsidliknande partikelstrukturerna (NCLP) av de icke-segmenterade negativa RNA-virusen (NNS) visar att de monterade NCLPs är det komplexa N med värdulära RNAs när de överuttrycks i bakteriella eller eukaryota uttryckssystem15,16,17,18,19. Tidigare studier har försökt få RNA gratis N med en mängd olika metoder, såsom RNase A matsmält…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningsprogram i Liang-laboratoriet vid Emory stöds av US National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH) under tilldelningsnummer R01GM130950 och Research Start-Up Fund vid Emory University School of Medicine. Författaren erkänner medlemmarna i Liang-laboratoriet för hjälpsamt stöd och kritisk diskussion.
Materials
| Agarose | SIgma | A9539-500G | making construct using LIC method |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore | UFC901024 | concentrate the protein sample |
| Ampicillin sodium | GOLD BIOTECHNOLOGY | 5118.111317A | antibiotic for cell culture |
| AseI | NEB | R0526S | making construct using LIC method |
| Cobalt (High Density) Agarose Beads | Gold Bio | H-310-500 | For purification of His-tag protein |
| Corning LSE Digital Dry Bath Heater | CORNING | 6885-DB | Heate the sample |
| dCTP | Invitrogen | 10217016 | making construct using LIC method |
| dGTP | Invitrogen | 10218014 | making construct using LIC method |
| Glycerol | Sigma | G5516-4L | making solution |
| HEPES | Sigma | H3375-100G | making solution |
| HiTrap Q HP | Sigma | GE29-0513-25 | Protein purification |
| Imidazole | Sigma | I5513-100G | making solution |
| IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) | GOLD BIOTECHNOLOGY | 1116.071717A | induce the expression of protein |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 47730-598 | for PCR |
| Misonix Sonicator XL2020 Ultrasonic Liquid Processor | SpectraLab | MSX-XL-2020 | sonicator for lysing cell |
| Negative stain grids | Electron Microscopy Sciences | CF400-Cu-TH | For making negative stain grids |
| New Brunswick Innova 44/44R | eppendorf | M1282-0000 | Shaker for culturing the cell |
| Nonidet P 40 Substitute | Sigma | 74385-1L | making solution |
| OneTaq DNA Polymerase | NEB | M0480L | PCR |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | Purify DNA |
| SSPI-HF | NEB | R3132S | making construct using LIC method |
| Superose 6 Increase 10/300 GL | Sigma | GE29-0915-96 | Protein purification |
| T4 DNA polymerase | Sigma | 70099-3 | making construct using LIC method |
| Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Fisher Scientific | 36-101-0816 | Centrifuge, highest speed 20,000 rpm |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T3253-250G | making solution |
| Uranyl Formate | Electron Microscopy Sciences | 22451 | making negative stain solution |
References
- Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).
- Lamb, R. A., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease. Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).
- Fearns, R., Deval, J. New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase. Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).
- Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA. Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).
- Pan, J., et al. Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex. Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).
- Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).
- Cao, D., et al. Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase. Nature Communications. 11 (1), 368 (2020).
- Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).
- Gilman, M. S. A., et al. Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex. Cell. 179 (1), 193-204 (2019).
- Liang, B., et al. Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy. Cell. 162 (2), 314-327 (2015).
- Jenni, S., et al. Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor. Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).
- Renner, M., et al. Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein. Elife. 5, 12627 (2016).
- Cox, R. M., Plemper, R. K. Structure and organization of paramyxovirus particles. Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).
- Desfosses, A., et al. Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape. Nature Communications. 4, 1429 (2013).
- Green, T. J., et al. Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses. Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).
- Jamin, M., Yabukarski, F. Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly. Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).
- Wan, W., et al. Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid. Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).
- Mendes, A., Kuhn, R. J. Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly. Viruses. 10 (3), (2018).
- Gao, Y., et al. In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus. Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).
- Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
- Green, R., Rogers, E. J. Transformation of chemically competent E. coli. Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).
- De Carlo, S., Harris, J. R. Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM. Micron. 42 (2), 117-131 (2011).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).
- Aebi, U., Pollard, T. D. A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic. Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).
- Green, T. J., et al. Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).
- Alvarez Paggi, D., et al. A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model. Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).
- Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex. Science. 313 (5785), 357-360 (2006).
- Tawar, R. G., et al. Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus. Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).
- Galloux, M., et al. Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein. Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).
- Milles, S., et al. Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence. Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).
- Desfosses, A., et al. Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).
