在体内成像完全活跃的脑组织在清醒斑马鱼幼虫和青少年由骷髅和皮肤去除
Summary
在这里，我们提出了一种方法，以图像斑马鱼胚胎大脑在体内到幼虫和幼年阶段。这种微创程序，根据电生理学方法改编，提供成熟神经元的细胞和亚细胞细节，并可与光遗传学和神经药理学研究相结合，以描述大脑功能和药物干预。
Abstract
了解大脑发育和成熟过程中发生的短暂变化需要在空间和时间上以细胞和亚细胞分辨率进行详细的高分辨率成像。分子和成像技术的进步使我们能够对透明斑马鱼胚胎中大脑发育的细胞和分子机制获得许多详细的见解。最近，在受精几周后的幼虫阶段发生的神经元连接的细化过程，例如控制社会行为、决策或动机驱动行为，已经进入研究重点。在这些阶段，斑马鱼皮肤的色素沉着会干扰光线渗透到脑组织，胚胎阶段的解决方案，例如，药理抑制色素沉着，已经不可行了。
因此，提供微创手术解决方案，用于通过微观镜进入清醒斑马鱼的大脑，该解决方案源自电生理方法。在电传中，皮肤和柔软的头骨软骨可以通过微皮这些层，暴露潜在的神经元和轴向而不损坏仔细去除。这允许记录神经元形态，包括突触结构及其分子含量，以及观察生理变化，如Ca2+ 瞬态或细胞内传输事件。此外，通过药理抑制或光遗传学操作来审讯这些过程是可行的。这种大脑暴露方法提供有关神经元结构和生理变化的信息，以及这些事件在几分钟或几小时内在活脑组织中的相关性和相互依存性。该技术适用于斑马鱼幼虫在受精后长达30天的体内脑成像，这是迄今为止测试的最新发育阶段。因此，它提供了诸如突触细化和缩放、轴突和树突运输、细胞骨骼货物突触靶向或当地活动依赖表达等重要问题。因此，可以预见这种安装和成像方法的广泛应用。
Introduction
近几十年来，斑马鱼（Danio rerio）已发展成为胚胎和幼虫发育研究中最受欢迎的脊椎动物模型生物之一。斑马鱼雌性的巨大雌性，加上胚胎 的快速前子宫 发育及其在早期胚胎发育阶段的透明度，只是使斑马鱼成为解决发育问题的强大模型有机体的几个关键因素。分子遗传技术的进步与体内成像研究 的高 分辨率相结合，使得解决细胞生物学机制基础发育过程2。特别是在神经元分化、生理学、连通性和功能领域，斑马鱼以前所未有的细节揭示了分子动力学、大脑功能和有机体行为的相互作用。
然而，由于神经系统组织的透明度逐渐丧失，这些研究大多局限于发育第一周的胚胎和早期幼虫阶段。在这些阶段，脑组织被高分辨率显微镜方法阻止进入，从而被头骨分化和色素沉着3所屏蔽。
因此，神经元分化、成熟度和可塑性等关键问题，如神经元连接性或突触缩放的细化，都难以研究。这些细胞过程对于定义细胞机制驱动非常重要，例如，社会行为、决策或基于动机的行为，斑马鱼对数周幼虫的研究最近根据行为研究贡献了关键发现。
药理学方法抑制斑马鱼幼虫色素的色素消耗几个星期是几乎不可行，甚至可能造成有害影响5，6，7，8。具有特定色素沉着缺陷的双突变株（如casper9或晶体10）已成为极其有价值的工具，但在育种方面非常费力，提供很少的后代，并且由于近亲繁殖过度而造成遗传畸形的积累危险。
在这里，提供最小侵入性程序作为替代，适用于任何斑马鱼菌株。这个程序是从电生理学研究中改编而来，记录活的和清醒的斑马鱼幼虫的神经元活动。在电传中，皮肤和柔软的头骨软骨可以通过微皮仔细去除这些层，因为它们没有与大脑血管紧密交织。这允许暴露含有神经元和轴突的脑组织而不造成损伤，并记录神经元形态，包括突触结构及其分子含量，这反过来又包括观察生理变化，如Ca2+ 瞬态或细胞内传输事件长达数小时。此外，除了描述性特征外，直接接触脑组织还可以通过神经药物管理和光遗传学方法对成熟的神经元功能进行审讯。因此，使用这种大脑暴露策略，可以在幼斑马脑中揭示出真正的结构功能关系。
Protocol
Representative Results
Discussion
提出的方法提供了一种替代方法，大脑隔离或斑马鱼幼虫的治疗与药物抑制色素干扰记录高分辨率图像的神经元在其 体内 环境。使用这种方法记录的图像质量可与从外生大脑中拍摄的图像相媲美，但在自然条件下。
此外，避免了荧光强度的损失，因为没有必要用固定剂18治疗。此外，这种方法不像隔离大脑那样具有侵入性，它只包括可能导致失败的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们特别感谢蒂莫·弗里奇出色的动物护理，赫尔曼·德林、穆罕默德·艾尔赛、索尔·波塞-门德斯、雅各布·冯·特罗塔、科马利·瓦利谢蒂和芭芭拉·温特给予我们帮助的支持。我们还感谢科斯特实验室的所有其他成员的反馈。该项目部分由德国研究基金会（DFG，KO1949/7-2）项目241961032（到RWK）和德国联邦委员会（BMBF）资助。时代网神经NII CIPRESS项目01EW1520到JCM）得到认可。
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
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