目覚めしたゼブラフィッシュ幼虫と頭蓋骨と皮膚除去による若年組織の完全に活性な脳組織のインビボイメージング
Summary
ここでは、幼虫および若年期までの生体内でゼブラフィッシュ胚性脳を画像化する方法を提示する。この微侵襲的な手順は、電気生理学的アプローチから適応され、成熟したニューロンの細胞および細胞内の詳細へのアクセスを提供し、脳機能および薬物介入を特徴付けるための光遺伝学および神経薬理学的研究と組み合わせることができる。
Abstract
脳の発達と成熟の間に起こる一時的な変化を理解するには、細胞および細胞内解像度での空間と時間における詳細な高解像度イメージングが必要です。分子および画像技術の進歩により、透明ゼブラフィッシュ胚における脳の発達の細胞および分子メカニズムに関する多くの詳細な洞察を得ることができています。最近では、受精の数週間後に起こる神経細胞の結合性の改善プロセスは、例えば社会的行動、意思決定、動機づけによる行動の制御など、研究の焦点に移っています。これらの段階では、ゼブラフィッシュ皮膚の色素沈着は、脳組織への光の浸透を妨げ、胚性段階の溶液、例えば、色素沈着の薬理学的阻害は、もはや実現不可能である。
従って、目覚めたゼブラフィッシュの脳への顕微鏡アクセスのための低侵襲外科的解決は、電気生理学的アプローチに由来する提供される。テレオストでは、皮膚および柔らかい頭蓋骨軟骨は、これらの層をマイクロ剥離することによって慎重に除去することができ、根底にあるニューロンおよび軸索管を損傷することなく露出させる。これにより、シナプス構造とその分子内容を含む神経形態、およびCa2+ 過渡性または細胞内輸送事象などの生理学的変化の観察を記録することができます。さらに、薬理学的阻害または光遺伝学的操作によってこれらのプロセスの尋問が可能である。この脳暴露アプローチは、ニューロンの構造的および生理学的変化に関する情報だけでなく、分または時間の範囲で生きている脳組織におけるこれらの事象の相関関係および相互依存性に関する情報を提供する。この技術は、受精後30日までのゼブラフィッシュ幼虫のインビボ脳イメージングに適している、これまでにテストされた最新の発達段階。したがって、シナプスの洗練とスケーリング、軸索および樹状輸送、細胞骨格貨物のシナプスターゲティング、または局所活動依存式などの重要な質問へのアクセスを提供します。したがって、この取り付けおよびイメージングアプローチの幅広い使用が期待できます。
Introduction
ここ数十年、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、胚性および幼虫発生研究のための最も人気のある脊椎動物モデル生物の一つとして進化してきました。初期胚発生期の胚の急速な 元子宮 の発達とその透明性と相まってゼブラフィッシュメスの大きな胎児性は、ゼブラフィッシュを発達の問題を和らげるための強力なモデル生物にする重要な要因のほんの一部である1。分子遺伝学的技術の進歩と高分解能 インビボ イメージング研究を組み合わせることで、発達過程の基礎となる細胞生物学的メカニズムに対処することが可能となった2.特に、神経細胞の分化、生理、接続性、機能の分野において、ゼブラフィッシュは、分子動力学、脳機能、および生物的挙動の相互作用をこれまでにない詳細に明示しています。
しかし、これらの研究のほとんどは、神経系組織の透明性が徐々に失われるため、発達の最初の週の間に胚および初期の幼虫段階に限定されている。これらの段階では、脳組織は、頭蓋骨の分化と色素沈着によって遮蔽される高分解能顕微鏡アプローチによってアクセスを妨げられる。
したがって、神経の分化、成熟、および神経の結合性の改良やシナプススケーリングなどの可塑性の主要な問題は研究が困難である。これらの細胞プロセスは、例えば、社会的行動、意思決定、または動機に基づく行動を駆動する細胞メカニズムを定義するために重要であり、数週間前の幼虫に関するゼブラフィッシュ研究が最近行動研究4に基づいて重要な知見を提供している領域。
ゼブラフィッシュ幼虫の色素沈着を数週間阻害する薬理学的アプローチは、ほとんど実現可能ではないか、5、6、7、8の有害な影響を引き起こす可能性さえある。キャスパー9や結晶10のような特定の色素沈着欠陥を有する二重または三重突然変異株は、非常に貴重な道具となっているが、繁殖に骨の折れる、少数の子孫を提供し、過剰な近親交配による遺伝的奇形を蓄積する危険性がある。
ここでは、任意のゼブラフィッシュ株に適用可能な代替として最小限の侵襲的手順が提供される。この手順は、生きていると目覚めたゼブラフィッシュ幼虫の神経活動を記録するために電気生理学的研究から適応されました.テレオストでは、皮膚および柔らかい頭蓋骨軟骨は、脳血管構造と密接に織り交ぜられていないため、これらの層をマイクロ剥離することによって慎重に除去することができる。これにより、ニューロンおよび軸索管を含む脳組織を損傷なく暴露し、シナプス構造とその分子内容物を含む神経形態を記録することができ、Ca2+ 過渡または細胞内輸送事象などの生理学的変化の観察を数時間まで含む。さらに、脳組織への直接的なアクセスは、記述的特徴付け以外にも、神経薬理学的物質の管理と光遺伝学的アプローチによる成熟した神経機能の問い合わせが可能です。したがって、この脳暴露戦略を用いて、真の構造機能関係を若年ゼブラフィッシュ脳で明らかにすることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示された方法は、脳の単離またはそれらの インビボ 環境でニューロンの高解像度画像を記録するための色素沈着を阻害する医薬品とゼブラフィッシュ幼虫の治療に代わるアプローチを提供する。この方法で記録された画像の品質は、自然な条件下で、植えられた脳からの画像に匹敵します。
さらに、固定剤18での治療は必要としないため、蛍?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
特に、ティモ・フリッチの優れた動物ケアとヘルマン・ドーリング、モハメド・エルザイ、ソル・ポーズ・メンデス、ヤコブ・フォン・トロサ、コマリ・ヴァリシェッティ、バーバラ・ウィンターの皆様の支援に感謝します。また、Kösterラボの他のすべてのメンバーの皆様のフィードバックに感謝しています。このプロジェクトの一部は、ドイツ研究財団(DFG、KO1949/7-2)プロジェクト241961032(RWK)とブンデスミニウム・フュル・ビルドゥン・ウント・フォルシュン(BMBF;エラネットニューロンII CIPRESSプロジェクト01EW1520にJCM)が認められる。
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Embryology. Zebrafish Development Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020)
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish ‘affective’ behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. . Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response – mother nature’s mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
