Imagerie in vivo de tissu cérébral entièrement actif chez des larves et des juvéniles de poissons-zèbres éveillés par enlèvement du crâne et de la peau
Summary
Nous présentons ici une méthode pour imager le cerveau embryonnaire du poisson-zèbre in vivo jusqu’aux stades larvaire et juvénile. Cette procédure micro-invasive, adaptée des approches électrophysiologiques, donne accès aux détails cellulaires et subcellulaires des neurones matures et peut être combinée avec des études optogénétiques et neuropharmacologiques pour caractériser la fonction cérébrale et l’intervention médicamenteuse.
Abstract
Comprendre les changements éphémères qui se produisent au cours du développement et de la maturation du cerveau nécessite une imagerie détaillée à haute résolution dans l’espace et le temps à la résolution cellulaire et subcellulaire. Les progrès des technologies moléculaires et d’imagerie nous ont permis d’acquérir de nombreuses connaissances détaillées sur les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement du cerveau dans l’embryon transparent de poisson-zèbre. Récemment, les processus de raffinement de la connectivité neuronale qui se produisent à des stades larvaires ultérieurs plusieurs semaines après la fécondation, qui sont par exemple le contrôle du comportement social, la prise de décision ou le comportement motivé par la motivation, sont passés au centre de la recherche. À ces stades, la pigmentation de la peau du poisson-zèbre interfère avec la pénétration de la lumière dans le tissu cérébral et les solutions pour les stades embryonnaires, par exemple l’inhibition pharmacologique de la pigmentation, ne sont plus réalisables.
Par conséquent, une solution chirurgicale mini-invasive pour l’accès microscopique au cerveau du poisson-zèbre éveillé est fournie qui est dérivée d’approches électrophysiologiques. Dans les téléostéens, la peau et le cartilage mou du crâne peuvent être soigneusement enlevés en micro-pelant ces couches, exposant les neurones sous-jacents et les voies axonales sans dommage. Cela permet d’enregistrer la morphologie neuronale, y compris les structures synaptiques et leur contenu moléculaire, et d’observer les changements physiologiques tels que les transitoires Ca2+ ou les événements de transport intracellulaire. En outre, l’interrogation de ces processus au moyen d’une inhibition pharmacologique ou d’une manipulation optogénétique est possible. Cette approche d’exposition cérébrale fournit des informations sur les changements structurels et physiologiques dans les neurones ainsi que sur la corrélation et l’interdépendance de ces événements dans les tissus cérébraux vivants de l’ordre de quelques minutes ou heures. La technique convient à l’imagerie cérébrale in vivo des larves de poisson zèbre jusqu’à 30 jours après la fécondation, le dernier stade de développement testé jusqu’à présent. Il donne ainsi accès à des questions aussi importantes que le raffinement et la mise à l’échelle synaptiques, le transport axonal et dendritique, le ciblage synaptique de la cargaison cytosquelettique ou l’expression dépendante de l’activité locale. Par conséquent, une large utilisation de cette approche de montage et d’imagerie peut être anticipée.
Introduction
Au cours des dernières décennies, le poisson-zèbre (Danio rerio) a évolué comme l’un des organismes modèles de vertébrés les plus populaires pour les études de développement embryonnaire et larvaire. La grande fécondité des femelles de poisson zèbre associée au développement rapide ex utero de l’embryon et à sa transparence au début du développement embryonnaire ne sont que quelques facteurs clés qui font du poisson-zèbre un organisme modèle puissant pour répondre aux questions de développement1. Les progrès des technologies de génétique moléculaire combinés à des études d’imagerie in vivo à haute résolution ont permis d’aborder les mécanismes biologiques cellulaires sous-jacents aux processus de développement2. En particulier, dans le domaine de la différenciation neuronale, de la physiologie, de la connectivité et de la fonction, le poisson-zèbre a mis en lumière l’interaction de la dynamique moléculaire, des fonctions cérébrales et du comportement de l’organisme avec des détails sans précédent.
Pourtant, la plupart de ces études sont limitées aux stades embryonnaires et larvaires précoces au cours de la première semaine de développement, car la transparence du tissu du système nerveux est progressivement perdue. À ces stades, le tissu cérébral est empêché d’y accéder par des approches de microscopie à haute résolution qui sont protégées par la différenciation et la pigmentation du crâne3.
Par conséquent, les questions clés de la différenciation neuronale, de la maturation et de la plasticité telles que le raffinement de la connectivité neuronale ou la mise à l’échelle synaptique sont difficiles à étudier. Ces processus cellulaires sont importants afin de définir les mécanismes cellulaires qui conduisent, par exemple, le comportement social, la prise de décision ou le comportement basé sur la motivation, domaines dans lesquels la recherche sur les larves de plusieurs semaines a récemment contribué à des résultats clés basés sur des études comportementales4.
Les approches pharmacologiques pour inhiber la pigmentation chez les larves de poisson zèbre pendant plusieurs semaines sont à peine réalisables ou peuvent même causer des effets néfastes5,6,7,8. Les souches doubles ou triples mutantes avec des défauts de pigmentation spécifiques, telles que le casper9 ou le cristal10,sont devenues des outils extrêmement précieux, mais sont laborieuses dans la reproduction, fournissent peu de progéniture et présentent le danger d’accumuler des malformations génétiques dues à une consanguinité excessive.
Ici, une procédure invasive minimale comme alternative est fournie qui est applicable à toute souche de poisson zèbre. Cette procédure a été adaptée à partir d’études électrophysiologiques pour enregistrer l’activité neuronale chez les larves de poisson zèbre vivantes et éveillées. Dans les téléostéens, la peau et le cartilage mou du crâne peuvent être soigneusement enlevés en micro-pelant ces couches, car elles ne sont pas étroitement imbriquées avec le système vasculaire cérébral. Cela permet d’exposer les tissus cérébraux contenant des neurones et des voies axonales sans dommage et d’enregistrer la morphologie neuronale, y compris les structures synaptiques et leur contenu moléculaire, qui à leur tour incluent l’observation de changements physiologiques tels que les transitoires Ca2+ ou les événements de transport intracellulaire pendant plusieurs heures. De plus, au-delà des caractérisations descriptives, l’accès direct au tissu cérébral permet d’interroger les fonctions neuronales matures au moyen de l’administration de substances neuropharmacologiques et d’approches optogénétiques. Par conséquent, de véritables relations structure-fonction peuvent être révélées dans le cerveau du poisson zèbre juvénile en utilisant cette stratégie d’exposition cérébrale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée fournit une approche alternative à l’isolement cérébral ou au traitement des larves de poisson zèbre avec des produits pharmaceutiques inhibant la pigmentation pour enregistrer des images à haute résolution des neurones dans leur environnement in vivo. La qualité des images enregistrées avec cette méthode est comparable aux images de cerveaux explantés, mais dans des conditions naturelles.
De plus, une perte d’intensité de fluorescence est évit?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tout particulièrement Timo Fritsch pour les excellents soins aux animaux et Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti et Barbara Winter pour leur soutien utile. Nous remercions également tous les autres membres du laboratoire Köster pour leurs commentaires. Le projet a été financé en partie par le projet 241961032 de la Fondation allemande pour la recherche (DFG, KO1949/7-2) (à RWK) et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS project 01EW1520 to JCM) est reconnu.
Materials
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
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